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周期素G2调控Wnt信号通路及抑制细胞增殖的研究

作　者: 高锦兰
导　师: 罗阳
学　校: 中国医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 周期素G2 经典Wnt信号通路 细胞周期 泛素化
分类号: R73-36
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


细胞周期是细胞生命活动的基本过程,其调控过程是调节细胞增殖的核心环节。一般认为细胞周期素(cyclin)的周期性表达、周期素结合并激活相应的细胞周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinease, CDK)对细胞周期进展起正性驱动作用；而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinease inhibitor, CKI)通过调节CDK的活性,对细胞周期进展起负调控作用。周期素、CDK和CKI多因素相互协同,共同影响细胞周期进程。细胞周期调控与细胞癌变关系十分密切,对细胞周期调控的研究将有助于阐明肿瘤的发生机制。周期素G2由定位于4q21.1的cyclin G2基因(CCNG2)编码,N端有典型的介导CDK结合相关的周期蛋白框(cyclin box)序列,C端含有与降解有关的PEST基序(PEST motif).周期素G2在小脑、胸腺、脾、前列腺和肾脏中表达较高。在细胞中,周期素G2的mRNA表达水平随细胞周期波动,在S期晚期达到最高,而在G2／M期转换时开始降低。本课题组前期研究发现周期素G2在口腔鳞癌中表达明显低于正常口腔黏膜组织,过表达周期素G2能够在体外抑制肿瘤细胞的克隆形成能力,表明周期素G2的作用不同于其他周期素,是调控细胞周期和细胞增殖的负性因子。最近国外一些研究表明周期素G2是一种核质穿梭蛋白,能够与蛋白质磷酸酶2A (protein phosphatase 2A, PP2A)结合；有学者通过基因芯片和小分子抑制剂研究,发现JNK (c-Jun amino-terminal kinase)信号通路和mTOR (mammalian target of rapamycin)信号通路影响周期素G2表达,但目前对于周期素G2负性调控细胞周期和细胞增殖的作用机制尚不清楚。为了进一步分析周期素G2负性调控细胞周期和抑制细胞增殖的作用机制,本课题组前期通过酵母双杂交技术筛选周期素G2的结合蛋白,找到35个非重复阳性克隆。通过对出现频率较高的几个蛋白进行序列比对和生物信息学分析,我们发现周期素G2很可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路(经典Wnt信号通路)对细胞周期和增殖起调节作用。经典Wnt信号通路在生物进化过程中极为保守,在细胞分化、细胞增殖及胚胎的生长发育过程中起重要调控作用。当细胞外Wnt信号分子与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合后激活胞内的Dishevelled蛋白,使糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase, GSK-3β)丧失磷酸化β-catenin的能力,导致β-catenin不能被泛素化降解。胞浆中β-catenin持续累积增多,当其浓度达到一定水平时就可以向细胞核内转移。在细胞核中，β-catenin与TCF/LEF转录因子家族(T-cell factor/lymphoid enhancer factor, TCF/LEF)结合,激活P-catenin的靶基因启动子,从而激活周期素D1和c-myc等经典Wnt信号通路的下游靶基因,进而调控细胞周期进程并发挥生物学效应。本课题拟在前期发现周期素G2抑制细胞克隆形成能力和在肿瘤细胞中低表达的基础上,进一步研究周期素G2对细胞增殖和细胞周期进程的调节作用。并在前期结果提示周期素G2可能参与经典Wnt信号通路调节过程的基础上,深入分析和验证周期素G2对经典Wnt信号通路的调控作用和分子机制,丰富细胞周期调控理论,为研究细胞周期调控在肿瘤发生发展中的作用提供理论基础。实验材料和方法1、周期素G2在胃粘膜细胞系和胃癌细胞系中的表达水平的研究提取胃粘膜细胞系GES-1、人胃腺癌高分化细胞系SGC-7901和人胃腺癌低分化细胞系MGC-803的总RNA, RT-PCR检测周期素G2的内源表达水平。2、周期素G2过表达影响细胞增殖的研究GES-1、SGC-7901以脂质体转染方法过表达周期素G2,利用细胞计数法检测周期素G2过表达对细胞增殖的影响。3、周期素G2过表达对经典Wnt信号通路关键因子β-catenin表达的影响逆转录病毒载体pLXSN-3×FLAG-G2或逆转录病毒对照载体与病毒包装载体pVSVG共转染病毒包装细胞GP-293,收集逆转录病毒颗粒用于感染HT-29、HeLa和非洲绿猴SV40转化的肾细胞系COS-7,使上述细胞过表达周期素G2,提取细胞总蛋白并通过Western blot检测周期素G2过表达对经典Wnt信号通路关键因子P-catenin表达水平的影响。4、周期素G2过表达对经典Wnt信号通路下游转录因子TCF/LEF转录活性的影响将真核表达载体pCMV-3×FLAG-BAP或pCMV-3×FLAG-G2与TCF/LEF荧光素酶载体pGL3-OT、pGL3-OF或空载体pGL3-basic和海肾荧光素酶载体pRL-TK共转染COS-7,48 h后检测荧光素酶活性,从而分析外源周期素G2过表达对经典Wnt信号通路下游转录因子TCF/LEF转录活性的影响。5、周期素G2过表达对经典Wnt信号通路下游靶蛋白c-Myc表达的影响逆转录病毒颗粒感染HT-29细胞使之过表达周期素G2,提取细胞总蛋白,通过Western blot检测经典Wnt信号通路下游靶蛋白c-Myc的表达水平。6、周期素G2过表达促进β-catenin降解的分子机制研究逆转录病毒颗粒感染HT-29细胞使之过表达周期素G2,提取细胞总蛋白,通过Western blot检测周期素G2对经典Wnt信号通路关键因子P-catenin磷酸化水平的影响；逆转录病毒颗粒感染HT-29细胞使之过表达周期素G2,加入蛋白酶体抑制剂MG-132抑制β-catenin泛素化降解,通过Western blot和间接免疫荧光(indirect immunofluorescence, IF)检测泛素化过程对周期素G2下调p-catenin表达的影响。实验结果1、周期素G2在胃癌细胞中表达水平低于胃粘膜正常细胞通过RT-PCR检测GES-1、SGC-7901和MGC-803中周期素G2的表达,经灰度扫描和统计学分析发现在人胃腺癌细胞SGC-7901和MGC-803中周期素G2表达水平低于胃粘膜正常细胞GES-1 (P<0.05);人胃腺癌低分化MGC-803细胞中周期素G2表达水平低于人胃腺癌高分化细胞SGC-7901,其内源表达水平与细胞恶性程度相关(P<0.05)2、周期素G2过表达抑制细胞增殖通过细胞计数法检测周期素G2对GES-1和SGC-7901细胞增殖的影响,经统计学分析发现周期素G2对上述几种细胞的增殖有抑制作用。3、周期素G2过表达引起经典Wnt信号通路的关键因子β-catenin表达下调逆转录病毒颗粒感染HT-29、HeLa和COS-7细胞使之过表达周期素G2,提取细胞总蛋白,通过Western blot检测周期素G2对经典Wnt信号通路关键因子β-catenin表达水平的影响,发现周期素G2过表达在HT-29、HeLa、COS-7细胞中均引起P-catenin表达明显下调,说明周期素G2过表达能够下调P-catenin蛋白表达水平。4、周期素G2过表达抑制经典Wnt信号通路下游转录因子TCF/LEF的转录活性按照实验设计将真核表达载体pCMV-3×FLAG-BAP或pCMV-3×FLAG-G2与TCF/LEF荧光素酶载体pGL3-OT、pGL3-OF或空载体pGL3-basic和海肾荧光素酶载体pRL-TK共转染COS-7细胞,48 h后检测荧光素酶活性,实验数据经统计学处理分析外源周期素G2对经典Wnt信号通路下游转录因子TCF/LEF转录活性的影响。实验结果表明COS-7细胞中过表达周期素G2后,反映TCF/LEF转录活性的相对荧光素酶活性明显低于对照组,说明周期素G2抑制经典Wnt信号通路下游转录活性。5、周期素G2过表达抑制经典Wnt信号通路下游靶蛋白c-Myc表达收集逆转录病毒颗粒感染HT-29细胞使之过表达周期素G2,提取细胞总蛋白,通过Western blot检测经典Wnt信号通路下游靶蛋白c-Myc的表达水平。实验结果表明周期素G2过表达的实验组c-Myc表达水平低于对照组,证明周期素G2过表达抑制经典Wnt信号通路下游靶蛋白c-Myc的表达。6、周期素G2过表达促进β-catenin经泛素化途径降解的分子机制逆转录病毒颗粒感染HeLa细胞使之过表达周期素G2,提取细胞总蛋白,通过Western blot检测细胞中P-catenin磷酸化水平的变化,发现实验组的P-catenin磷酸化水平明显高于对照组。逆转录病毒颗粒感染HT-29细胞使之过表达周期素G2,实验组加入蛋白酶体抑制剂MG-132抑制P-catenin泛素化降解,对照组加入溶剂DMSO,通过Western blot和IF检测发现MG-132实验组周期素G2过表达不能下调P-catenin表达水平,而DMSO对照组中周期素G2过表达明显下调P-catenin表达水平。以上结果提示周期素G2过表达通过促进P-catenin磷酸化进而进入泛素化系统降解。结论1、周期素G2过表达抑制体外培养细胞的增殖。2、周期素G2过表达下调经典Wnt信号通路关键因子P-catenin、抑制经典Wnt信号通路下游转录因子TCF/LEF转录活性和靶蛋白c-Myc的表达。3、周期素G2过表达上调P-catenin磷酸化水平,促使其通过泛素化途径降解,从而对经典Wnt信号通路产生负调控作用。

全文目录


中文论著摘要  4-9
英文论著摘要  9-13
英文缩略语  13-14
论文  14-37
  前言  14-15
  实验材料和方法  15-27
  实验结果  27-33
  讨论  33-35
  结论  35
  小结  35-37
本研究创新性的自我评价  37-38
参考文献  38-42
综述  42-47
在学科研成绩  47-48
致谢  48-49
个人简介  49

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 肿瘤学实验研究 > 治疗实验
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