学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

SUMO化修饰对芳香烃受体AhR调控机制的研究

作　者: 过倩萍
导　师: 伍会健
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 芳香烃受体 二恶英 SUMO化 去SUMO化 HeLa细胞
分类号: Q343
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 85次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor, AhR)是一种碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix (bHLH)) PAS (Per-Arnt-Sim homology domain)蛋白,属于bHLH超家族的转录因子。在外界环境激素,如2,3,7,8-四氯-二苯并-对-二恶英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,2,3,7,8-TCDD)的刺激下,可以从细胞质转运入细胞核中,并且与AhR核转运蛋白ARNT(AhR nuclear transportor)结合,形成异二聚体,结合在下游靶基因上,激活引起相应基因,如细胞色素CYP1A1/CYP1B1(cytochrome P450 1A1/cytochrome P450 1B1)等的异常表达,最终引起对细胞的毒害,从而干扰动物的内分泌,引起免疫毒性,甚至导致癌症的发生。在AhR激活的过程当中,涉及多种蛋白修饰的变化,如磷酸化、泛素化等。但是至今仍然没有关于SUMO化的报导。而SUMO化作为细胞内一种普遍的修饰方式,可以调节蛋白的定位、活性、稳定性等等。因此,本文旨在确定细胞内AhR蛋白可以发生SUMO化修饰,并且对这种修饰的功能进行研究,为预防和治疗二恶英所引起的疾病如癌症等提供坚实的理论基础。全文的具体内容及结果如下：在人子宫内膜癌细胞HeLa中,利用蛋白质免疫共沉淀实验,以AhR抗体进行免疫沉降,以SUMO-1抗体进行检测,确定内源性的AhR蛋白存在SUMO化修饰。同时利用PCR的方法构建了带有Flag标签的人源AhR的表达质粒,将其转入HeLa细胞内后,以Flag抗体进行Western Blotting检测,进一步确定外源的AhR也可以被SUMO化。与此同时,转入去SUMO化蛋白酶SENP1的表达质粒,发现可以削弱AhR的修饰,从而也确定了AhR的去SUMO化酶。二恶英TCDD是AhR的激动剂,以TCDD对HeLa细胞进行刺激。利用蛋白质免疫共沉淀的方法进行检测。发现10 nM TCDD对AhR的SUMO化就可起削弱作用,且这种削弱作用具有时间依赖性,在20 min后开始,1 h时达到较为明显的效果。同时这种作用的产生需要在血清存在的条件下,这是因为血清起维持AhR-SUMO-1蛋白的稳定性,使AhR对TCDD的刺激反应更为明显。但TCDD对AhR的去SUMO化作用并未体现出浓度依赖性。利用核质分离的方法,再以蛋白质免疫共沉淀的方法进行检测,发现TCDD所引起的AhR的去SUMO化作用,主要发生在细胞核当中。而利用AhR和SUMO-1的抗体再进行免疫荧光,也进一步证实了这个结论。这说明,TCDD可能通过激活细胞核内的SENP1,从而促进核内AhR的去SUMO化,并且引起AhR的激活及后续的降解。综上所述,本研究首次发现了AhR蛋白被SUMO蛋白修饰,并且这种修饰在TCDD的作用下逐渐减弱。由于大部分的AhR-SUMO蛋白主要聚集在细胞核当中,其去SUMO化亦主要在细胞核当中发生。这使得AhR在去SUMO化之后,可以立刻与ARNT形成二聚体,激活下游基因的表达,从而快速地对外界环境的刺激作出应答。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-13
1 文献综述  13-25
  1.1 AhR概述  13-18
    1.1.1 AhR的结构定位与激活过程  13-16
    1.1.2 AhR的修饰方式  16-17
    1.1.3 AhR通路与其他通路的交叉  17
    1.1.4 AhR的功能  17-18
  1.2 SUMO化概述  18-23
    1.2.1 SUMO在结构上与泛素相关  19-20
    1.2.2 SUMO化机制  20-21
    1.2.3 SUMO的功能  21-23
    1.2.4 SUMO化修饰与信号转导  23
    1.2.5 SUMO与疾病  23
  1.3 本论文的选题依据和研究内容  23-25
    1.3.1 选题依据  23-24
    1.3.2 研究内容  24-25
2 内源性AhR SUMO化修饰的鉴定  25-33
  2.1 引言  25
  2.2 仪器与试剂  25-28
    2.2.1 仪器  25-26
    2.2.2 试剂  26-28
  2.3 实验方法  28-30
    2.3.1 细胞培养  28
    2.3.2 免疫共沉淀  28
    2.3.3 Western Blotting  28-29
    2.3.4 考马斯亮蓝法测蛋白浓度  29-30
  2.4 结果与讨论  30-32
    2.4.1 HeLa细胞内AhR的SUMO化修饰情况  30-32
  2.5 小结  32-33
3 外源性AhR SUMO化修饰的鉴定  33-46
  3.1 引言  33
  3.2 仪器与试剂  33-36
    3.2.1 仪器  33
    3.2.2 试剂  33-36
  3.3 实验方法  36-40
    3.3.1 PCR构建p3×Flag-CMV-AhR质粒  36-37
    3.3.2 质粒转化  37-38
    3.3.3 以高纯度质粒小提中量试剂盒进行质粒提取  38-39
    3.3.4 质粒的酶切鉴定  39
    3.3.5 质粒的测序鉴定  39
    3.3.6 哺乳动物细胞外源转染  39
    3.3.7 Western Blotting  39-40
    3.3.8 考马斯亮蓝法测蛋白浓度  40
  3.4 实验结果与讨论  40-45
    3.4.1 PCR方法构建的p3×Flag-CMV-AhR质粒可高效表达  40-43
    3.4.2 外源性Flag-AhR可以被SUMO-1修饰  43-44
    3.4.3 SENP1介导了AhR的去SUMO化  44-45
  3.5 小结  45-46
4 TCDD对AhR的去SUMO化的影响  46-55
  4.1 引言  46
  4.2 仪器与试剂  46
    4.2.1 仪器  46
    4.2.2 试剂  46
  4.3 实验方法  46-47
    4.3.1 细胞培养  46-47
    4.3.2 免疫共沉淀  47
    4.3.3 Western Blotting  47
    4.3.4 考马斯亮蓝法测蛋白浓度  47
  4.4 结果与讨论  47-54
    4.4.1 血清饥饿后TCDD对AhR的SUMO化修饰无影响  47-49
    4.4.2 血清培养后TCDD对AhR SUMO修饰的减弱不依赖于浓度梯度  49-51
    4.4.3 血清的培养有利于维持AhR蛋白的稳定性  51-52
    4.4.4 血清培养后TCDD对AhR SUMO修饰的减弱依赖于时间梯度  52-54
  4.5 小结  54-55
5 SUMO化修饰对于AhR在细胞中定位的影响  55-64
  5.1 引言  55
  5.2 仪器与试剂  55-57
    5.2.1 仪器  55
    5.2.2 试剂  55-57
  5.3 实验方法  57-58
    5.3.1 细胞培养  57
    5.3.2 核质分离  57
    5.3.3 免疫共沉淀  57
    5.3.4 Immunoblotting  57
    5.3.5 考马斯亮蓝法测蛋白浓度  57-58
    5.3.6 免疫荧光  58
  5.4 结果与讨论  58-62
    5.4.1 核质分离证实TCDD促使细胞核中AhR的去SUMO化  58-60
    5.4.2 免疫荧光进一步证实TCDD促使细胞核内AhR的去SUMO化  60-61
    5.4.3 TCDD对于AhR在细胞中的分布源于血清刺激  61-62
  5.5 小结  62-64
结论  64-65
参考文献  65-70
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  70-71
致谢  71-73

相似论文

  1. 蜂毒肽基因的原核重组表达及其在Hela细胞中的靶向转录研究,R346
  2. MG-132减轻大鼠肠缺血再灌注肝损伤：伴有AhR和核因子κB信号通路的改变,R363
  3. 核桃外果皮抑制人宫颈癌HeLa细胞活性成分筛选,R284
  4. 口蹄疫病毒结构蛋白VP4基因的真核表达,S852.65
  5. 医疗废物典型组分物理化学特性认识及其热解焚烧特性的基础研究,X799.3
  6. 二恶英类化合物快速检测系统的初步构建,X502
  7. 硒化枸杞多糖硫酸酯的制备及其体外生物活性研究,R285.5
  8. 对REGγ在癌症信号通路中作用及其若干修饰的研究,R730.2
  9. 脂麻花醇提物体外抗肿瘤生物活性及其机理的初步研究,R285.5
  10. 紫草素等提取物对体外HeLa细胞增殖的影响,R285
  11. 1.人脑低级神经胶质瘤组织和癌旁组织的差异蛋白质组学研究 2.Hela细胞系导入TRIM45基因后的比较蛋白质组学研究,R739.41
  12. 雷帕霉素在顺铂诱导Hela细胞凋亡中的协同作用,R737.33
  13. 甘草素（liquirigenin）诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡及其分子机制的研究,R737.33
  14. 异常黑胆质成熟剂总酚与化疗药联合对Hela细胞的影响,R737.33
  15. EGCG诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及其机制研究,R737.33
  16. 柯萨奇病毒B3对Hela细胞mTOR/p70S6K表达的调控作用,R737.33
  17. RNA干扰靶向沉默STAT1基因对宫颈癌细胞Hela生物学特性的影响,R737.33
  18. 酯型儿茶素对HeLa细胞增殖的影响及其制剂（阴道载体栓）的质量标准研究,R943
  19. MG132联合顺铂对人宫颈癌Hela细胞裸鼠移植瘤和细胞内p65表达的影响,R737.33
  20. HIC-1基因在宫颈癌Hela细胞中的表达及其甲基化调控,R737.33

中图分类: > 生物科学 > 遗传学 > 遗传学分支学科 > 细胞遗传学
© 2012 www.xueweilunwen.com