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八助游仆虫中心蛋白N端及其突变体的金属结合性质

作　者: 赵冰
导　师: 杨斌盛
学　校: 山西大学
专　业: 无机化学
关键词: 中心蛋白N端 Tb3+ TNS 构象变化聚集
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

中心蛋白是一种分子量约为20 kD的酸性蛋白,属于高度保守的钙调蛋白EF-hand超家族,广泛存在于多种生物体,如酵母、藻类、原生动物、高等植物和哺乳动物等的中心体(基体或纺锤极体)中,参与中心体的复制与分离、纤维的收缩和鞭毛切除等过程。八肋游仆虫中心蛋白(EoCen)由两个相对独立的区域(N端和C端)组成,每端包含两个EF-手结构域和两个钙离子结合位点。为了研究八肋游仆虫中心蛋白N端loop区首个氨基酸的生物功能,我们通过分子生物学方法构建了N端半分子的突变体N-D37K和N-D73K(D是天冬氨酸,K是赖氨酸)。首先利用PCR技术,在全分子突变体D37K的基础上通过截短构建得到了N端突变体N-D37K,然后通过定点突变的方法构建得到了另一个N端突变体N-D73K。DNA序列测定表明所得突变体只有目的位点的基因发生突变,而无其他任何位点的随机突变。将重组质粒导入大肠杆菌BL21感受态细胞中,在诱导剂IPTG的诱导下实现目的蛋白的可溶性表达。融合蛋白通过PPase酶切和GST亲和层析后得到纯的目的蛋白。同时将野生型蛋白(EoCen)和课题组之前构建完成的N端野生型蛋白(N-EoCen)诱导表达纯化得到目的蛋白。经SDS-PAGE分析显示,所得蛋白均不含杂蛋白条带,达到实验所需的纯度。本文运用荧光、电泳和电化学等方法研究了中心蛋白N端及其突变体与金属离子(Ca2+/Tb3+)的结合性质。铽离子荧光敏化实验和共振光散射实验证明,N-D73K可以结合两个Tb3+,这与N端野生型N-EoCen一致,而N-D37K只能结合一个Tb3+。同时,我们得到了Tb3+与中心蛋白Ⅱ部位的结合常数KⅡ-Tb=(8.31±0.18)×104M-1。通过Ca2+与Tb3+竞争N-D37K的结合位点的实验,我们得到了Ca2+与中心蛋白Ⅱ部位之间的结合常数KⅡ-Ca=(0.94±0.12)×102M-1。用TNS作为疏水探针,我们研究了中心蛋白N端及其突变体结合金属离子后的构象变化,与N-EoCe、N-D73K相比,N-D37K的构象几乎不发生变化,同时得到了TNS与Tb3+饱和的N-EoCen和N-D37K的结合常数,K(Tb3+-N-D37K-TNS)=(6.57±0.89)×106M-1和K(Tb3+-N-EoCen-TNS)=(9.35±0.05)×105M-1。通过共振光散射实验和化学交联实验,我们对N-EoCen、N-D73K、N-D37K的聚集性质的研究发现：与N-EoCen、N-D73K相比,N-D37K几乎不聚集。另外,我们还对影响聚集的其他物理化学因素做了研究。总的研究结果表明,当loopI区的第一个氨基酸Asp37突变为赖氨酸后,N-EoCen的第一个金属离子结合位点丧失了金属结合能力,进而影响了中心蛋白N端依赖于金属离子的构象变化和聚集性质,表明Asp37对EoCen的N端金属结合起重要作用。Eu3+在-0.2V～-1.2V电位扫描范围内具有较好的电化学活性,本文利用Eu3+灵敏的电化学行为初步对中心蛋白N端的金属离子结合性质进行了研究。

全文目录

摘要  12-14
ABSTRACT  14-16
第一章综述  16-23
  §1.1 引言  16
  §1.2 中心蛋白的种类  16
  §1.3 中心蛋白的结构  16-18
  §1.4 中心蛋白的定位  18
  §1.5 中心蛋白的功能  18-21
    1.5.1 绿藻中心蛋白  18-19
    1.5.2 酵母中心蛋白  19-20
    1.5.3 哺乳动物细胞中心蛋白  20
    1.5.4 高等植物中心蛋白  20
    1.5.5 原生生物中心蛋白  20-21
  §1.6 中心蛋白的作用机制  21
  §1.7 课题的研究目的和意义  21-23
第二章中心蛋白N端突变体的构建、表达和纯化  23-41
  §2.1 引言  23
  §2.2 材料  23-28
    2.2.1 菌种与质粒  23
    2.2.2 寡核苷酸  23-24
    2.2.3 主要酶及生化试剂  24
    2.2.4 主要试剂配制过程  24-27
    2.2.5 主要仪器  27-28
  §2.3 方法  28-37
    2.3.1 N-端单天冬氨酸突变体重组质粒(pGEM-T-Easy-N-D37K)的构建  28-32
    2.3.2 N-端单天冬氨酸突变体重组质粒(pGEM-T-Easy-N-D73K)的构建  32-35
    2.3.3 重组菌N-D37K和N-D73K的诱导表达  35
    2.3.4 表达蛋白的纯化  35-37
  §2.4 结果与讨论  37-40
    2.4.1 突变重组质粒的酶切鉴定和测序结果  37-39
    2.4.2 重组菌N-D37K和N-D73K的诱导表达及纯化  39-40
  §2.5 本章结论  40-41
第三章中心蛋白N端突变体的金属结合性质  41-47
  §3.1 引言  41
  §3.2 材料  41
    3.2.1 主要试剂  41
    3.2.2 主要仪器  41
  §3.3 方法  41-42
    3.3.1 脱钙蛋白溶液的制备  41-42
    3.3.2 蛋白浓度测定  42
    3.3.3 Tb~(3+)储备液的配制  42
    3.3.4 荧光光谱测定  42
  §3.4 结果与讨论  42-46
    3.4.1 突变蛋白的变性胶电泳和天然胶电泳分析  42-43
    3.4.2 中心蛋白N端及其突变体的Tb~(3+)荧光敏化  43-44
    3.4.3 Tb~(3+)与N-D37K和N-D73K结合常数的计算  44-45
    3.4.4 Ca~(2+)与中心蛋白及其突变体结合常数的计算  45-46
  §3.5 本章结论  46-47
第四章中心蛋白N端及其突变体的构象变化  47-54
  §4.1 引言  47
  §4.2 材料  47
    4.2.1 主要试剂  47
    4.2.2 主要仪器  47
  §4.3 方法  47-48
    4.3.1 脱钙蛋白溶液的制备  47
    4.3.2 蛋白浓度测定  47
    4.3.3 Tb~(3+)储备液的配制  47
    4.3.4 TNS溶液的配制  47-48
    4.3.5 圆二色谱的测定  48
    4.3.6 荧光光谱测定  48
  §4.4 结果与讨论  48-53
    4.4.1 中心蛋白N端及其突变体的Far-UV CD谱  48
    4.4.2 TNS检测的金属离子诱导的蛋白构象变化  48-51
    4.4.3 中心蛋白N端及其突变体和TNS结合常数的测定  51-52
    4.4.4 Tb~(3+)滴定TNS饱和蛋白的荧光分析  52-53
  §4.5 本章结论  53-54
第五章中心蛋白N端及其突变体的聚集性质  54-64
  §5.1 引言  54
  §5.2 材料  54-55
    5.2.1 主要试剂  54-55
    5.2.2 主要仪器  55
  §5.3 方法  55
    5.3.1 脱钙蛋白溶液的制备  55
    5.3.2 蛋白浓度测定  55
    5.3.3 Tb~(3+)储备液的配制  55
    5.3.4 荧光共振光散射光谱的测定  55
    5.3.5 蛋白化学交联分析  55
  §5.4 结果与讨论  55-63
    5.4.1 浓度对中心蛋白N端聚集的影响  55-56
    5.4.2 温度对中心蛋白N端聚集的影响  56-58
    5.4.3 其他物理化学因素对中心蛋白N端聚集的影响  58-60
    5.4.4 金属离子诱导的中心蛋白N端及其突变体的聚集  60-61
    5.4.5 中心蛋白N端及其突变体的聚集的化学交联分析  61-63
  §5.5 本章结论  63-64
第六章中心蛋白N端金属离子结合性质的电化学研究  64-72
  §6.1 引言  64
  §6.2 材料  64-65
    6.2.1 主要试剂  64
    6.2.2 主要仪器  64-65
  §6.3 方法  65
    6.3.1 Eu~(3+)储备液的配制  65
    6.3.2 脱钙蛋白溶液的制备  65
    6.3.3 蛋白浓度测定  65
    6.3.4 电化学实验  65
  §6.4 结果与讨论  65-71
    6.4.1 Eu~(3+)与小分子配位的电化学行为  65-69
    6.4.2 Eu~(3+)与中心蛋白N-EoCen配位的电化学行为  69-71
  §6.5 本章结论  71-72
第七章总结与展望  72-74
  §7.1 总结  72-73
  §7.2 展望  73-74
参考文献  74-80
攻读学位期间取得的研究成果  80-81
致谢  81-82
个人简况及联系方式  82-84

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