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桃种胚的离体培养及再生植株的RAPD分析

作　者: 潘雪涛
导　师: 王永清
学　校: 四川农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 桃 非正常种胚 组织培养 遗传多样性 RAPD
分类号: S662.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 61次
引　用: 1次
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内容摘要


桃种子中存在一定频率的非正常种子,本研究以这种非正常种子为试材,建立了桃胚离体再生体系,并运用RAPD技术对再生的非正常种子苗进行遗传多样性分析。主要研究结果如下:1.外植体表面灭菌处理:先用75%的酒精处理30s,再用0.1%升汞处理10min,最后再用无菌水清洗5次的灭菌处理效果最佳,种胚污染率15.52%,种胚成活率可达81.03%。2.种胚的启动萌发:MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D0.25mg/L最有利于种胚的萌发,萌发率96.67%,且萌发的芽苗有大量侧芽,平均芽苗数达2.54个,增殖倍数达3.9,利于后阶段的继代增殖培养。3.在继代增殖:MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.3mg/L最利于组培苗的继代与增殖,增殖倍数为3.73。此配方既能保证较高的增殖率,又能保证较好的芽苗质量,且玻璃化率和褐化率最低。4.壮苗和生根培养:（1）最佳的壮苗培养基配方为:Ca元素加倍的MS+IBA0.3mg/L+6-BA0.75mg几,并加入0.2mg/L的PP333,平均芽苗高度可达2.98cm,且芽苗质量最优,能为接下来的生根培养提供壮苗。（2）最佳生根诱导处理方法为:用浓度为100mg/LIBA浸蘸30min后,接种于含0.1%活性碳的1/2MS培养基上,16℃暗培养7天后再转入25℃光照下培养,见光后1周内可生根,生根率80%,每株平均生根数达6.50条,平均根长7.13cm。5.炼苗移栽:采用“三步炼苗法”,最终成活率达到70%。6.本研究采用改良CTAB法提取DNA。PCR采用25μl反应体系:其中引物浓度2μmol/L,Mg2+的浓度为25mmol/L,dNTP的浓度为10mmol/L,Taq酶浓度为2.5U,Buffer25mmol/L,DNA模板浓度为40ng。反应程序为:93℃2min,36℃1min,72℃2min,1次循环;93℃1min,36℃1min,72℃2min,42次循环;93℃1min,36℃1min,72℃10min,1次循环。扩增完毕后4℃保存,于1.2%琼脂糖凝胶电泳分离。7.从62个随机引物中筛选出了20个条带数量多且清晰、多态性好的随机引物作为本试验的PCR扩增引物,其中12个引物表现出了遗传多样性。总共得到2621条清晰谱带,其中非正常种子苗扩增条带1465条,得到特异性谱带248条,占总条带数的9.44%,占非正常种苗条带的16.89%。分子标记显示:正常种子苗与非正常种子苗之间存在特异性条带,而正常种子苗间却未表现出差异,且播种繁殖和组织培养所得的非正常种子苗表现出了相同的特异性条带,表明特异性条带的出现来自非正常种子本身,而非组织培养过程中诱变造成的,即外形非正常的种子的确存在丰富的遗传多样性。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-10
1. 文献综述  10-18
  1.1 桃胚培养  10-15
    1.1.1 植株再生途径  12-13
    1.1.2 外植体及其发育状态  13-14
    1.1.3 培养基及其附加物  14-15
    1.1.4 培养条件  15
  1.2 RAPD技术在桃上的应用  15-18
    1.2.1 桃种质资源遗传多样性的研究  16-17
    1.2.2 发现和检测桃基因位点上的突变及新遗传资源的鉴定  17
    1.2.3 构建桃分子遗传图谱  17-18
2. 本研究的目的和意义  18
3. 研究的材料和方法  18-28
  3.1 试验材料  18-19
  3.2 技术路线  19
  3.3 研究内容及方法  19-28
    3.3.1 种子的分类及播种育苗  19-20
    3.3.2 接种和启动萌发  20-21
      3.3.2.1 外植体表面灭菌  20
      3.3.2.2 不同基本培养基与激素配比的影响  20-21
    3.3.3 继代与增殖  21-23
      3.3.3.1 不同培养基及生长素对增殖的影响  21-22
      3.3.3.2 不同激素对增殖的影响  22-23
    3.3.4 壮苗和生根  23-25
      3.3.4.1 壮苗培养  23-24
      3.3.4.2 不同因素对组培苗生根的影响  24-25
    3.3.5 炼苗与移栽  25-26
    3.3.6 培养条件  26
    3.3.7 遗传多样性的 RAPD分析  26-28
      3.3.7.1 主要试剂及仪器  26
      3.3.7.2 DNA的提取  26-27
      3.3.7.3 RAPD随机引物的筛选  27
      3.3.7.4 PCR反应及电泳检测  27-28
  3.4 试验结果的观测与统计分析  28
4. 结果与分析  28-45
  4.1 不同表面灭菌处理对外植体的影响  28-30
  4.2 不同培养基及激素配比对种胚启动萌发效果的影响  30-32
  4.3 继代与增殖  32-35
    4.3.1 不同培养基对桃芽苗增殖效果的影响  32-33
    4.3.2 不同细胞分裂素对芽苗增殖效果的影响  33-35
  4.4 壮苗培养  35-36
  4.5 生根培养  36-39
  4.6 炼苗与移栽  39
  4.7 再生植株的 RAPD分析  39-45
    4.7.1 引物的筛选  39-40
    4.7.2 RAPD扩增结果  40-45
5. 讨论  45-52
  5.1 各因素对桃种胚启动萌发的影响  45-46
  5.2 基本培养基对桃芽苗继代增殖的影响  46-47
  5.3 植物生长素种类和浓度对桃芽苗继代增殖的影响  47
  5.4 玻璃化和枯梢的控制  47-48
  5.5 各因素对桃组培苗诱导生根的影响  48-50
  5.6 桃非正常种子在育种中的应用  50-52
参考文献  52-56
致谢  56-57
附图(Plate)  57-59

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 核果类 > 桃
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