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醋酸甲孕酮单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

作　者: 蔡小丽
导　师: 吴金节；王权
学　校: 安徽农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 醋酸甲孕酮单克隆抗体间接竞争酶联免疫吸附法
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

醋酸甲孕酮(Medroxyprogesterone Acetate,MPA)是一种人工合成的激素,在畜牧业生产中,曾被用作动物生长促进剂。由于醋酸甲孕酮有致乳腺癌的作用,我国和欧盟已禁止在动物性食品生产中使用该药物。国内外已建立了很多理化方法检测动物性食品中残留的醋酸甲孕酮。虽然有些方法比较灵敏精确,但由于花费大、时间长、技术要求高等原因而不适合大批量样品的筛选。作为一种快速、灵敏、特异的方法,酶联免疫吸附测定正逐渐应用于药物的残留检测。本研究通过抗原的合成和抗体的制备,建立了MPA的ELISA测定方法。本文采用O-(羧甲基)羟胺法合成醋酸甲孕酮-3-(O-羧甲基)肟(MPS)半抗原。用二环己基碳化二亚胺偶联法分别将醋酸甲孕酮-3-(O-羧甲基)肟与牛血清白蛋(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联合成人工完全免疫原和包被抗原。用紫外扫描和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对人工抗原进行初步鉴定,确定偶联成功。分光光度法估算MPS-BSA、MPS-OVA中半抗原与载体蛋白的偶联比率,最后测MPS-BSA的偶联比为19:1;MPS-OVA偶联比为18:1。用人工合成的醋酸甲孕酮-牛血清白蛋白(MPA-BSA)作为抗原免疫BALB/C小鼠4次后,间接ELISA测定免疫小鼠体内的MPA抗体效价,取1只免疫效果最佳小鼠的脾细胞,在PEG作用下与SP2/0细胞融合,利用杂交瘤技术筛选得到2株稳定分泌醋酸甲孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C11A3B6和4C11G8H6。对这两株细胞的上清和腹水进行效价测定,其细胞培养上清效价分别为1:640和1:320,腹水效价分别为1:2.56×106和1:1.6×106。对两株单抗进行鉴定:杂交瘤细胞染色体数分别为99.64±1.5和99.35±1.5,其分泌的抗体亚型均为IgG2а。将两株细胞经体外传代和多次冻存复苏后,其抗体分泌稳定。利用4C11A3B6杂交瘤细胞株的腹水单抗建立检测醋酸甲孕酮残留的间接竞争ELISA方法。绘制出醋酸甲孕酮间接竞争ELISA检测方法的标准曲线: y=-30.022LogC+90.191,R2=0.9911,此方法可测定的最适范围为1～100ng/mL;ciELISA检测显示其IC50为22ng/mL。在可测定范围内,孔雀石绿、无色孔雀石绿、己烯雌酚、四环素、恩诺沙星、呋喃唑酮、呋喃西林、氯霉素、青霉素等可能会因为同时使用而导致共同残留的药物未显示交叉反应性,表明该单抗具有较好的敏感性和特异性。本研究通过将MPA转化为人工抗原,免疫小鼠,成功地制备出了醋酸甲孕酮抗血清和单克隆抗体,为研制拥有我国自主知识产权的醋酸甲孕酮残留免疫检测试剂盒提供了一个良好的技术平台。

醋酸甲孕酮单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

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