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氯苯乙烯三甲基吡嗪对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用研究

作　者: 翟丽
导　师: 郭秀丽
学　校: 山东大学
专　业: 药理学
关键词: 氯苯乙烯三甲基吡嗪 HUVECs H2O2 氧化损伤细胞凋亡 NO ERK1/2 Caspase-3
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

心脑血管疾病是致死率和致残率最高的临床常见病和多发病,是世界卫生组织（WHO）认定的危害人类健康的“头号杀手”。血管内皮细胞功能障碍是多种心脑血管疾病发病的共同环节,它触发和促进动脉粥样硬化、高血压、心肌梗塞等。多种因素,如急性缺血、中毒、氧化应激、同型半胱氨酸血症等都可引起血管内皮细胞肿胀、脱落、凋亡、坏死等损伤。川芎嗪是中药川芎的主要有效成分之一,具有清除氧自由基、钙拮抗、扩张血管、抗血小板聚集和血栓形成等多种作用,广泛应用于临床治疗。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化,生成极性和水溶性较大的代谢物而被迅速排出体外,所以川芎嗪存在半衰期短,生物利用度低等缺点。经川芎嗪及其衍生物构效关系研究,证实吡嗪环为其基本药效基团;2,3,5,6位甲基为药代基团。芪类衍生物具有抗血小板聚集、降血压等广泛的心脑血管活性,其代表化合物白黎芦醇的心脑血管活性得到了大家的一致认可。因此,以白黎芦醇为结构模型,在保持其基本骨架不变的前提下,以吡嗪环替代其中一个苯环,即在川芎嗪侧链上引入取代苯乙烯基,设计合成了一系列川芎嗪芪类衍生物,其中根据生物电子等排体原理,将OH以电子等排体Cl^-替代,设计合成了氯取代衍生物反式-2-（2-氯苯乙烯）-3,5,6-三甲基吡嗪。以白藜芦醇的活性基团取代川芎嗪分子的药代基团,以期克服川芎嗪体内半衰期短、生物利用度低等缺点,并通过协同作用增强药效,提高抗心脑血管疾病作用。本实验采用过氧化氢作为外源性自由基生成系统,模拟血管内皮细胞的脂质过氧化损伤,建立离体培养的血管内皮细胞氧化应激损伤模型,观察2-（2-氯苯乙烯）-3,5,6-三甲基吡嗪对氧化损伤的血管内皮细胞的保护作用及其可能的机制,为其用于心、脑血管疾病治疗提供进一步的资料,同时也为传统中药的开发提供新思路。1.氯苯乙烯三甲基吡嗪对H₂O₂氧化损伤HUVECs细胞存活力的影响采用MTT法测定细胞存活力。实验结果显示,HUVECs细胞氧化损伤后,细胞活力显著降低（P＜0.001）。经氯苯乙烯三甲基吡嗪25、50、100μmol/L处理后细胞活力明显增强（P＜0.001）。2.氯苯乙烯三甲基吡嗪对H₂O₂氧化损伤HUVECs细胞内LDH（乳酸脱氢酶）释放率的影响收集氧化损伤处理后的HUVECs细胞培养上清液和细胞裂解液,参照试剂盒说明分别测定培养上清液和细胞裂解液中的LDH活性,计算细胞LDH释放率。实验结果表明,HUVECs细胞经H₂O₂损伤后,细胞膜通透性增加,胞内LDH漏出增多,培养液中LDH活力显著增加（P＜0.01）。经氯苯乙烯三甲基吡嗪25、50、100μmol/L处理后,明显抑制细胞内LDH的释放（P＜0.01）。3.氯苯乙烯三甲基吡嗪对H₂O₂氧化损伤HUVECs细胞内MDA和GSH含量、SOD活力的影响收集氧化损伤处理后的HUVECs细胞内蛋白。参照MDA、SOD、GSH检测试剂盒说明分别测定细胞MDA、GSH含量、SOD活力。实验结果表明,细胞氧化损伤后MDA与GSH含量显著增加（P＜0.01）,SOD活力显著降低（P＜0.001）。经氯苯乙烯三甲基吡嗪25、50、100μmol/L处理后,细胞MDA含量显著减少（P＜0.01）;GSH含量和SOD活力显著增高（P＜0.01）。4.氯苯乙烯三甲基吡嗪对H₂O₂损伤HUVECs细胞内NO含量和NOS活性收集氧化损伤处理后的HUVECs细胞内蛋白。参照NO和NOS检测试剂盒说明分别测定细胞NO含量、NOS活力。实验结果表明,氧化损伤后胞内NO含量显著增加（P＜0.01）,NOS活力显著降低（P＜0.01）。经氯苯乙烯三甲基吡嗪25、50、100μmol/L处理后,细胞NO含量显著减少（P＜0.01）;NOS活力显著升高（P＜0.01）。5.川芎嗪二苯甲基哌嗪对H₂O₂氧化损伤ECV-304细胞染色质的影响细胞经处理后,以多聚甲醛室温固定,Hoechst 33258染色并于荧光显微镜下观察并拍照。实验结果表明,细胞经Hoechst 33258染色后,正常组细胞核较大且染色均匀;模型组细胞核内可见致密的颗粒状荧光,呈现出凋亡细胞典型的核固缩、核碎裂表现;氯苯乙烯三甲基吡嗪各浓度组细胞的胞核形态趋于正常,凋亡细胞数明显减少。6.氯苯乙烯三甲基吡嗪对H₂O₂氧化损伤HUVECs细胞凋亡率的影响细胞经处理后,以Annexin V-FITC/PI双染后上流式细胞仪检测。实验结果表明,与正常组比较,模型组细胞的凋亡率明显升高（P＜0.01）。与模型组比较,氯苯乙烯三甲基吡嗪各浓度组细胞的凋亡率降低,差异有显著统计学意义（P＜0.01）。7.氯苯乙烯三甲基吡嗪对H₂O₂氧化损伤HUVECs细胞胞内ERK1/2蛋白,P-ERK1/2蛋白表达的影响细胞经处理后,按Western blotting方法检测ERK1/2蛋白,P-ERK1/2蛋白表达。实验结果表明,与正常组相比,模型组细胞ERK1/2蛋白表达无明显变化,由于H₂O₂的刺激使细胞本身产生保护细胞促其生存的应激反应,作为促进细胞生存途径中的重要蛋白P-ERK1/2表达明显增高（P＜0.01）。经氯苯乙烯三甲基吡嗪100μmol/L处理后,细胞的ERK1/2蛋白表达仍无明显变化,与过氧化氢损伤组相比,p-ERK1/2表达明显增加（P＜0.05）,这是由于本药物可能通过上调促细胞生存蛋白p-ERK1/2表达增加从而抵御氧化应激。8.氯苯乙烯三甲基吡嗪对H₂O₂氧化损伤HUVECs细胞胞内Caspase-3蛋白表达的影响细胞经处理后,按Western blotting方法检测Caspase-3蛋白表达。实验结果表明,模型组细胞caspase-3蛋白表达明显增加（P＜0.01）。经氯苯乙烯三甲基吡嗪100μmol/L处理后,细胞的caspase-3蛋白表达蛋白表达明显减少（P＜0.05）。

全文目录

中文摘要  8-11
Abstract  11-15
符号说明  15-17
前言  17-20
实验材料  20-22
实验方法  22-25
  1 细胞培养及分组  22
    1.1 细胞培养  22
    1.2 细胞分组及处理  22
  2 实验项目及检测指标  22-24
    2.1 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞活性的影响  22-23
    2.2 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞产生自由基的影响  23
    2.3 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞凋亡的影响  23-24
      2.3.1 Hoechst 33258荧光染色法观察细胞核形态  23
      2.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡率  23-24
      2.3.3 细胞内NO含量和NOS活性的测定  24
      2.3.4 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞表达ERK1/2,p-ERK1/2,Caspase-3蛋白的影响  24
  3 数据处理  24-25
实验结果  25-42
  1 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞活性的影响  25-28
    1.1 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞存活力的影响  25-26
    1.2 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞LDH漏出率的影响  26-28
  2 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞产生自由基的影响  28-31
    2.1 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞MDA含量的影响  28
    2.2 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞SOD活力的影响  28
    2.3 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞GSH含量的影响  28-31
  3 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞凋亡的影响  31-35
    3.1 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞染色质的影响  31
    3.2 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞凋亡率的影响  31
    3.3 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞产生NO的影响  31-32
    3.4 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞NOS活性的影响  32-35
  4 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞表达ERK1/2,p-ERK1/2,Caspase-3蛋白的影响  35-42
    4.1 CSTMP对H2O2损伤HUVECs细胞表达ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的影响  35-39
    4.2 CSTMP对H_2O_2损伤HUVECs细胞表达Caspase-3蛋白的影响  39-42
讨论  42-50
结论  50-51
附图  51-53
参考文献  53-56
致谢  56-57
攻读硕士学位论文期间发表的论文  57-58
内质网应激介导的细胞凋亡途径及新靶点药物  58-66
NO调节细胞凋亡的作用机制研究进展  66-72
学位论文评阅及答辩情况表  72

氯苯乙烯三甲基吡嗪对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用研究

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