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目的:本实验复制中波紫外线照射白色雌性小鼠的黄褐斑实验动物模型,给予美肤汤灌服,将最终研究所得的各项生化指标及病理学观察结果与黄褐斑的作用机理相结合,加以检测、分析,进一步探讨美肤汤防治黄褐斑的药效学机制;为明确美肤汤治疗黄褐斑的显著效果提供可靠的实验方法及理论依据。材料和方法:选取清洁级白色雌性小鼠72只,体重30g左右,将筛选合格的小鼠随机分成6组,每组12只。分别为空白对照组、模型对照组、美肤汤低剂量组、美肤汤中剂量组、美肤汤高剂量组、阳性药物对照组。采用中波紫外线照射白色雌性小鼠复制黄褐斑实验动物模型。按分组编号,所有动物分笼饲养。于实验前24h将所有动物脊柱两侧及靠臀部皮肤分别用10%NaS2水溶液背部脱毛,然后用清水将残留物清洗干净,以暴露背部大部分皮肤。每周脱毛一次,共四周,取材之前再进行一次脱毛,并于取材前一小时禁食。除正常对照组外,以波长为320nm的中波紫外线每日照射小鼠背部皮肤1次,照射时间60min,动物与光源的距离为20cm。连续照射四周,并观察小鼠的脱毛部位皮肤变化情况。采用中波紫外线照射白色雌性小鼠4周后,灌服美肤汤煎剂,按照人体临床用药剂量标准,每100斤人体体重给予285g美肤汤的生药量。换算所得,平均小鼠每10g体重给予0.6g生药量,每只小鼠体重平均30士2g,由此可知平均小鼠每天生药量为0.18g/只,(相当于人体临床标准剂量)。空白对照组、模型对照组两组动物分别灌服生理盐水0.5ml/只,持续6周;美肤汤低、中、高剂量组分别灌服2、4、8倍人体临床标准剂量美肤汤煎剂,每日一次,持续六周。阳性药物对照组:给予维生素C丸0.1g/只,研磨成粉,溶于0.5ml蒸馏水中灌服,每日一次,持续六周。治疗6周后,截止取材时,除去灌胃期间死亡的小鼠,取材小鼠共72只于取材前再进行一次脱毛,并于最后一次9灌药60min后将所有小鼠断颈处死,迅速取其受试肝脏及脱毛后皮肤组织标本(1.5* 1.5cm),经(4°C)的预冷生理盐水漂洗标本,除去血液和皮下脂肪以及其他结缔组织,然后用滤纸拭干,并切取皮肤和肝脏标本各0.5g,分别放入9倍于组织标本的预冷生理盐水的小试管内,将组织剪碎后倒入玻璃匀浆管中,用细胞粉碎机匀浆(肝脏2次,皮肤4次),每次5S。将匀浆好的10%的匀浆液用离心机以3500r/min离心15min,取上清液,严格按酪氨酸、SOD试剂盒说明书操作,进行指标测定。另外分别取小鼠去毛皮肤1块(1.0X 1.0cm),10%福尔马林固定,常规石蜡包埋切片,黑色素标记采用免疫组织化学技术,再经脱蜡至水、抗原修复后,用HMB45(melanoma黑素瘤)为第一抗体,免疫组化二步法,DAB显色,苏木素复染,用PBS代替一抗做阴性对照,用于病理形态学的检测。结果:1.复制中波紫外线照射白色雌性小鼠的黄褐斑实验动物模型成功。(1)UVB对小鼠皮肤、肝脏中酪氨酸、SOD含量的影响中波紫外线照射四周后,模型对照组小鼠与空白对照组相比,皮肤与肝脏中酪氨酸含量明显升高,具有显著差异(P<0.05);皮肤与肝脏中超氧化歧化酶(SOD)活性明显降低,具有显著差异(P<0.05)。(2)UVB对小鼠皮肤黑色素细胞的个数、数密度、平均灰度、平均光密度含量影响模型对照组小鼠与空白对照组相比,靶目标内黑色素阳性细胞的个数和数密度均明显增多,具有显著差异(P<0.05);黑色素阳性细胞平均灰度明显下降,差异显著(P<0.05);小鼠皮肤内黑色素阳性细胞的平均光密度含量显著增多,有统计学意义(P<0.05)。2.美肤汤可有效影响黄褐斑实验动物模型的指标(1)美肤汤对小鼠皮肤、肝脏中酪氨酸、SOD含量的影响美肤汤高、中、低剂量组与模型对照组比较,酪氨酸含量明显降低,超氧化物歧化酶(SOD)活性明显升高,差异显著,有统计学意义(P<0.05),美肤汤高、中剂量组与阳性药物对照组比较,酪氨酸含量明显降低,超氧化物歧化酶(SOD)活性明显升高,差异显著,有统计学意义(P<0.05),美肤汤低剂量组与阳性药物对照组比较,酪氨酸含量与超氧化物歧化酶(SOD)活性无显著性差异,没有统计学意义(P>0.05)。(2)美肤汤对小鼠皮肤黑色素细胞的个数影响美肤汤高、中、低剂量组经灌服美肤汤后,黑色素阳性细胞个数呈下降趋势,跟模型对照组比较,有统计学意义(P<0.05)。美肤汤高、中剂量组与阳性药物对照组比较,明显下降,差异显著(P<0.05)。美肤汤低剂量组与阳性药物对照组比较,没有统计学意义(P>0.05)。(3)美肤汤对小鼠皮肤数密度含量影响美肤汤高、中、低剂量组经灌服美肤汤后,小鼠皮肤靶目标内黑色素细胞的数密度呈下降趋势,跟模型对照组比较,有统计学意义(P<0.05)。美肤汤高、中剂量组与阳性药物对照组比较,明显下降,差异显著(P<0.05)。美肤汤低剂量组与阳性药物对照组比较,没有统计学意义(P>0.05)。(4)美肤汤对小鼠皮肤黑色素阳性细胞的平均灰度的影响美肤汤低、中、高剂量组灌服美肤汤后,小鼠皮肤靶目标内黑色素阳性细胞平均灰度呈上升趋势,跟模型对照组比较,有统计学意义(P<0.05)。美肤汤中、高剂量组与阳性药物对照组比较,明显提高,差异显著(P<0.05)。美肤汤低剂量组与阳性药物对照组比较,没有统计学意义(P>0.05)。(5)美肤汤对小鼠皮肤黑色素细胞的平均光密度的影响美肤汤高、中、低剂量组经灌服美肤汤后,小鼠皮肤靶目标内黑色素阳性细胞平均光密度呈下降趋势,跟模型对照组比较,有统计学意义(P<0.05)。美肤汤高、中剂量组与阳性药物对照组比较,明显下降,差异显著(P<0.05)。美肤汤低剂量组与阳性药物对照组比较,没有统计学意义(P>0.05)。结论:1.复制中波紫外线照射白色雌性小鼠黄褐斑实验动物模型造模成功。2.美肤汤防治黄褐斑的机制可能是与抗氧化,减少皮肤与肝脏组织中酪氨酸含量,提高SOD活性,有效抑制皮肤黑素细胞增殖,从而减少黑素合成有关。3.美肤汤治疗黄褐斑疗效显著。
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