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人呼吸道合胞病毒微型复制子功能的初步研究

作　者: 唐倩
导　师: 何金生
学　校: 安徽医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 人呼吸道合胞病毒微型复制子增强型绿色荧光蛋白聚合酶大亚基蛋白转录延长/转录终止抑制因子
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,RSV)广泛分布于世界各地,是导致婴幼儿严重下呼吸道感染最重要的病毒病原,目前尚无有效的治疗方法。利用RNA病毒反向遗传学操作获得的减毒RSV活病毒,具有稳定的安全性和良好的免疫原性。为开展RSV反向遗传学研究奠定基础,拟先尝试开展RSV微型复制子(minireplicon)构建及功能的初步研究。RSV微型复制子一般包括RSV病毒前导序列(Leader, genomic promoter, Le)、转录起始信号(gene start, GS)、可插入外源基因的多克隆酶切位点(mutiple cloning site, MCS)、转录终止信号(gene end, GE)和尾随序列(Trailer, antigenomic promoter, Tr)。通过引入T7 RNA多聚酶(T7 RNA polymerase, T7 RNP)启动子、克隆入载体px8δT等多步操作,可获得RSV微型复制子质粒,经转染可提供T7 RNP及RSV复制所必须的全部蛋白的细胞,可了解RSV微型复制子能否实现RSV基因组的复制和转录功能。本研究在于构建和表达RSV复制必须的两种重要功能蛋白大蛋白( Large protein,L )和转录延长/转录终止抑制因子(transcription elongation/antitermination factor,M2 ORF 1 protein,M2-1),结合先前构建的RSV微型复制子质粒等,完成RSV微型复制子质粒功能的初步研究。方法:此前我们人工合成了含RSV Le、GS、MCS、GE和Tr的GSGE基因片段,PCR方法分别在GSGE片段的5′和3′端引入T7RNA多聚酶启动子获得GSGE1及GSGE2片段,并分别克隆入载体px8δT,获得RSV微型复制子质粒px8δT/GSGE1和px8δT/GSGE2,进一步将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)开放读码框(Open Reading Frame, ORF)分别克隆入px8δT/GSGE1和px8δT/GSGE2 ,获得RSV微型复制子重组质粒px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP。本研究中我们构建了可表达两种核壳体蛋白或聚合酶蛋白的真核表达质粒,包括表达L蛋白的质粒pcDNA3.1/L及表达M2-1蛋白的质粒pcDNA3.1/M2-1。通过脂质体法共转染RSV微型复制子重组质粒及核壳体蛋白质粒(包括先期构建的可表达RSV核蛋白(nucleoprotein, N)及磷蛋白(phosphoprotein, P)的质粒, pcDNA3.1/N和pcDNA3.1/P)至可表达T7 RNA多聚酶(T7 RNA polymerase, T7 RNP)的BSR T7/5细胞系,倒置荧光显微镜及流式细胞仪分析EGFP的表达情况。结果:经限制性内切酶分析及核酸序列分析,证明成功构建了pcDNA3.1/L和pcDNA3.1/M2-1,经RT-PCR及western blot分析证实L及M2-1蛋白有表达,五质粒共转染BSR T7/5细胞,倒置荧光显微镜及流式细胞仪均观察到绿色荧光。结论:成功克隆A亚型RSV Long株L和M2-1基因,并在真核细胞中获得表达。构建的RSV微型复制子具有转录和复制功能,为进一步的RSV反向遗传操作奠定了基础。

全文目录

中英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
实验设计与流程  11-12
前言  12-14
实验材料与方法  14-28
结果  28-32
讨论  32-36
结论  36-37
参考文献  37-39
附录  39-40
致谢  40-41
综述  41-47

人呼吸道合胞病毒微型复制子功能的初步研究

内容摘要

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