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电场辅助离子束介导基因转化试验研究

作　者: 邢永飞
导　师: 梁运章
学　校: 内蒙古大学
专　业: 生物物理学
关键词: 电场 DNA电泳 离子束 转基因 GUS基因 瞬间表达
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 34次
引　用: 1次
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内容摘要


参照常规的拟南芥室内栽培技术,建立了一种新型的MS培养基法与水培方法相结合的拟南芥室内培养体系。试验结果表明,种子萌发阶段采用MS固体培养基,苗期改用改良的1/4Hoagland营养液,可栽培出生长健壮的拟南芥植株。此方法较传统的土培法和水培法都有明显的改善。以能量为20keV,剂量为0-400×2.6×1013ions/cm2的N+离子束注入拟南芥愈伤组织,分别采用常规方法和TTC法检测离子注入后拟南芥愈伤组织的失水率和细胞活力。结果发现拟南芥愈伤组织的失水率随离子注入剂量的增加而增加,回归分析显示愈伤组织的失水率与注入剂量之间有显著的线性关系;愈伤组织细胞活力随离子注入剂量变化关系为“马鞍”型曲线,曲线回归分析表明三次方程是细胞活力随离子注入剂量变化的最佳曲线方程,250×2.6×1013ions/cm2为后续检测基因转化效率的最佳离子注入剂量。对水平电泳槽和竖直电泳槽内DNA分布情况进行了定性和定量分析,证明了DNA在电场的作用下由负极向正极泳动,得到了DNA在纯水溶液中随电泳时间的延长降解情况严重这一重要结论。设计并制作了一个新型、特殊而且有效的电泳槽用于辅助低能离子束介导基因转化试验,分别利用DNA浸泡法和DNA电泳法转pBI121质粒至N+注入后的拟南芥愈伤组织,GUS检测结果表明,DNA电泳法明显优于惯用的DNA浸泡法。DNA浸泡法中GUS基因的瞬时高表达只是在愈伤组织的表面部分,而且蓝色斑点较浅;而DNA电泳法得到的GUS基因的瞬时高表达已深入愈伤组织内部,而且蓝色斑点或条纹较深。当DNA电泳时间为10分钟时,GUS基因的瞬间表达率最高（82.7%）,同时瞬间高表达频率（51.1%）要比DNA浸泡法（7.5%）高出5.8倍之多。不同处理方法的多重比较结果显示,10-15分钟是DNA电泳辅助离子束介导基因转化的最佳时间。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章 绪论  12-23
  1.1 离子束生物技术简介  12-17
    1.1.1 离子注入系统介绍  12-13
    1.1.2 离子束诱变育种技术  13-14
    1.1.3 离子束介导的遗传转化技术  14-17
    1.1.4 离子束生物技术的应用展望  17
  1.2 转基因技术简介  17-19
    1.2.1 农杆菌介导法  17-18
    1.2.2 基因枪法  18
    1.2.3 聚乙二醇(PEG)介导法  18
    1.2.4 电穿孔法  18
    1.2.5 花粉管通道法  18-19
    1.2.6 其他方法  19
  1.3 拟南芥研究概况  19-21
    1.3.1 拟南芥的生物学特性  19-20
    1.3.2 拟南芥的研究历史  20
    1.3.3 拟南芥研究的应用前景  20-21
  1.4 报告基因的选择  21
  1.5 本文的研究意义和主要内容  21-23
第二章 拟南芥植株室内培养体系的建立  23-28
  2.1 引言  23
  2.2 材料与方法  23-25
    2.2.1 植物材料  23-24
    2.2.2 分子生物学和生化试剂  24
    2.2.3 培养基  24
    2.2.4 拟南芥种子的消毒  24
    2.2.5 拟南芥无菌苗的生长  24
    2.2.6 拟南芥的水培体系  24-25
  2.3 结果与讨论  25-27
    2.3.1 拟南芥的生长情况  25-26
    2.3.2 影响拟南芥菜生长的因素  26-27
  2.4 小结  27-28
第三章 离子束注入拟南芥愈伤组织实验体系的建立  28-36
  3.1 引言  28
  3.2 材料与方法  28-30
    3.2.1 植物材料  28-29
    3.2.2 分子生物学和生化试剂  29
    3.2.3 拟南芥组织培养基  29
    3.2.4 拟南芥种子的消毒  29
    3.2.5 拟南芥无菌苗的生长  29
    3.2.6 愈伤组织的诱导  29
    3.2.7 甘油预处理  29
    3.2.8 离子束注入拟南芥愈伤组织  29
    3.2.9 离子注入愈伤组织后失水率的统计  29
    3.2.10 细胞存活力测定  29-30
    3.2.11 数据处理  30
  3.3 结果与讨论  30-35
    3.3.1 拟南芥愈伤组织生长情况  30
    3.3.2 不同剂量离子注入对愈伤组织失水率的影响  30-31
    3.3.3 离子注入过程中愈伤组织失水率的回归分析  31-32
    3.3.4 不同剂量离子注入对愈伤组织细胞活力的影响  32-33
    3.3.5 离子注入过程中愈伤组织细胞活力的回归分析  33-35
  3.4 小结  35-36
第四章 电场辅助离子束介导基因转化试验初探  36-50
  4.1 引言  36-37
  4.2 材料与方法  37-42
    4.2.1 植物材料  37
    4.2.2 菌种和质粒  37-38
    4.2.3 分子生物学和生化试剂  38
    4.2.4 细菌培养基  38
    4.2.5 甘油预处理  38
    4.2.6 离子束注入拟南芥愈伤组织  38
    4.2.7 质粒DNA的提取  38
    4.2.8 DNA电泳时其浓度分布的测定  38-39
    4.2.9 质粒DNA浸泡转入愈伤组织  39
    4.2.10 电场辅助质粒DNA转入愈伤组织  39-41
    4.2.11 固定染色法检测GUS活性  41
    4.2.12 观察和照像  41
    4.2.13 GUS瞬间表达率的计算  41
    4.2.14 数据处理  41-42
  4.3 结果与讨论  42-48
    4.3.1 水平电泳槽DNA分布情况  42
    4.3.2 竖直电泳槽DNA分布情况  42-43
    4.3.3 试验用电泳槽的设计与制作  43-44
    4.3.4 DNA浸泡与电场辅助介导对GUS染色情况的影响  44-48
  4.4 小结  48-50
第五章 结论及展望  50-52
  5.1 结论  50
  5.2 展望  50-52
参考文献  52-57
附录  57-58
致谢  58-59
攻读硕士期间完成的学术论文  59

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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