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DES及INSL3对体外培养小鼠睾丸引带细胞中LGR8转录和表达的影响

作　者: 段守兴
导　师: 李建宏
学　校: 汕头大学
专　业: 外科学
关键词: 已烯雌酚 胰岛素样因子3 G蛋白耦联受体8 睾丸引带 细胞培养
分类号: R726.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:近年来研究表明环境雌激素(EEs)对男性生殖系统的影响日益明显,且大多数与睾丸的下降不全及发育不良有关,而睾丸引带在睾丸的下降和发育过程中一直被认为扮演着重要角色。研究证实胰岛素样因子3(INSL3)参与引带发育、睾丸下降的过程。INSL3通过与其特异性受体LGR8结合而在第一阶段(经腹下降期)发挥主要作用,且LGR8高表达于睾丸引带之上,但有关其具体作用机制尚未完全研究清楚。本实验通过体外培养小鼠睾丸引带细胞,利用不同浓度己烯雌酚(DES)和INSL3直接作用于培养的小鼠睾丸引带细胞,以探讨DES和INSL3对小鼠睾丸引带细胞中LGR8 mRNA及蛋白表达的影响及其与小鼠睾丸下降的可能关系。材料与方法:将刚出生3日龄的雄性昆明小鼠显微剖出其睾丸引带组织并进行细胞培养。传代培养后随机分组,按DES浓度分为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、DMSO溶剂对照组和正常对照组;按INSL3浓度分为20ng/ml、2ng/ml、0.2ng/ml、0.02ng/ml和正常对照组。在倒置显微镜下观察细胞形态并应用免疫荧光对LGR8进行亚细胞定位。加药持续作用48h,用Trizol法提取总RNA,紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度及完整性。然后应用RT-PCR分析不同浓度DES及INSL3作用后小鼠睾丸引带细胞中LGR8 mRNA的表达情况。将药物作用48h后的细胞收集制成细胞悬液,通过流式细胞术分析小鼠睾丸引带细胞中LGR8蛋白的表达水平。结果:1.体外培养的小鼠睾丸引带细胞大部分为成纤维样细胞,有少数的上皮样细胞。胞体呈梭形或不规则三角形,胞质有突起。传代后细胞仍呈成纤维细胞型生长,同源性好,存活率约90%。高剂量DES作用48h后细胞失去成纤维型形态,胞浆收缩,胞体呈不规则类椭圆型。2.细胞免疫荧光方法发现LGR8表达于细胞膜上,且表达较高。3. DES各实验组与正常组相比,10μg/ml组睾丸引带细胞LGR8 mRNA及蛋白表达水平升高(P <0.01),1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml组表达下降(P <0.01或P <0.05),DMSO组LGR8 mRNA及蛋白水平的表达均无显著性差异( P >0.05)。4. INSL3各实验组中0.02ng/ml组睾丸引带细胞LGR8 mRNA及蛋白水平的表达高于正常对照组(P<0.01),20ng/ml、2ng/ml、0.2ng/ml组与正常组相比均无显著性差异(P >0.05)。结论:1.体外培养小鼠睾丸引带细胞呈成纤维细胞型生长,传代后细胞同源性好,存活率高。大剂量DES可导致小鼠睾丸引带细胞形态异常、结构紊乱。2.免疫荧光确认LGR8在睾丸引带细胞膜上表达,且表达较高。3.高剂量的DES可使睾丸引带细胞中LGR8的表达水平升高。4.极低剂量的INSL3能上调睾丸引带细胞中LGR8的表达量。5.实验证实高剂量的DES和极低剂量的INSL3均可使睾丸引带细胞中LGR8的表达水平上升,又因高剂量的DES和极低剂量的INSL3都与睾丸下降不全有关,继而推测DES和INSL3可能通过LGR8作用途经来影响睾丸引带的发育。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
主要缩略语中英文对照表  8-12
第一章 前言  12-14
第二章 实验技术路线  14-15
第三章 材料与方法  15-24
  1. 材料  15-17
    1.1 标本来源  15
    1.2 试剂与药品  15-16
    1.3 仪器与设备  16
    1.4 主要液体配制  16-17
  2. 方法  17-23
    2.1 细胞培养  17-20
    2.2 细胞免疫荧光  20
    2.3 RT-PCR  20-23
    2.4 流式细胞术  23
  3. 统计学处理  23-24
第四章 结果  24-35
  1. 小鼠睾丸引带细胞培养及DES 对其形态的影响  24-25
    1.1 倒置显微镜观察  24-25
    1.2 HE 染色  25
  2. 免疫荧光染色  25-26
  3. RT-PCR  26-31
    3.1 RNA 纯度及完整性分析  26-27
    3.2 DNA 测序结果  27-29
    3.3 不同浓度DES 对小鼠睾丸引带细胞LGR8 mRNA 表达的影响  29
    3.4 不同浓度INSL3 对小鼠睾丸引带细胞LGR8 mRNA 表达的影响  29-31
  4. 流式细胞术  31-35
    4.1 不同浓度DES 对小鼠睾丸引带细胞LGR8 蛋白表达的影响  31-32
    4.2 不同浓度INSL3 对小鼠睾丸引带细胞LGR8 蛋白表达的影响  32-35
第五章 讨论  35-43
  1. 睾丸引带和睾丸下降的关系  35-36
  2. DES 与睾丸引带发育的影响  36-37
  3. INSL3 与LGR8  37-39
  4. 免疫荧光对LGR8 亚细胞定位  39-40
  5. DES/INSL3 对睾丸引带细胞中LGR8 mRNA 及蛋白表达的影响  40-42
  6. 小结与展望  42-43
第六章 结论  43-44
参考文献  44-50
综述一  50-55
  参考文献  53-55
综述二  55-62
  参考文献  59-62
发表论文情况  62
参加学术会议  62-63
个人简历  63-64
致谢  64

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  20. 胰岛素样因子3对培养小鼠睾丸引带细胞的影响,R726.9

中图分类: > 医药、卫生 > 儿科学 > 小儿外科学 > 小儿泌尿科学
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