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嗅鞘细胞促损伤大鼠耳蜗螺旋神经节细胞保护和修复作用的实验研究

作　者: 张志存
导　师: 余洪猛
学　校: 复旦大学
专　业: 耳鼻喉科
关键词: 嗅鞘细胞 细胞培养 免疫荧光化学染色 硫酸卡那霉素 耳聋 脑干听觉诱发电位 大鼠 螺旋神经节细胞 细胞移植
分类号: R764
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


第一部分嗅鞘细胞的体外培养、纯化、标记及鉴定目的：纯化、培养、标记和鉴定成年大鼠嗅球OECs,为后续实验做准备。方法：取新生大鼠嗅球,去除包膜后,经胰酶消化,获得含有OECs的混合细胞悬液,采用两次长时差速贴壁的方法纯化OECs,在含有bFGF、NGF、10%FBS的DF12中培养,每隔2d半量更换培养基。倒置显微镜下观察OECs的生长状态,采用P75NTR和GFAP细胞免疫组化的方法鉴定OECs, Hoechst33342标记细胞核,荧光显微镜下观察OECs的形态并统计纯度。结果：嗅球消化后获得的细胞悬液经过两次长时差速贴壁后去除了绝大部分的污染细胞,包括成纤维细胞和星形胶质细胞,接种的OECs约24小时后贴壁,倒置显微镜下观察见大部分细胞胞体呈现梭形,部分细胞胞体为多角形,伸出突起,培养7d后见OECs覆盖皿底的90%,形成一细胞单层。P75NTR和GFAP染色见约92%的细胞染色阳性,分布在突起、胞体；Hoechst 33342标记率几乎可以达到100%,可见细胞核染成蓝色。结论：采用两次长时差速贴壁的方法能够获得实验所需纯度的OECs。第二部分成年大鼠硫酸卡那霉素耳毒性模型的建立目的：建立成年大鼠硫酸卡那霉素耳毒性模型,为后续实验做准备。方法：6-7周龄雄性SD大鼠60只,随机分为3组：实验组(1),腹腔注射KM,500 mg/Kg perd (100mg/ml)2周；实验组(2)腹腔注射KM,400 mg/Kg per d (80mg/ml)2周；对照组,注射等量生理盐水2周。采用ABR的方法观察大鼠听力变化,基底膜铺片观察毛细胞形态及数量变化,耳蜗冰冻切片观察SGCs的密度及形态学变化。结果：实验组(1)注射KM 2周后,大鼠在各频率的听觉阈值均有明显升高,其上升幅度超过60 dB；实验组(2)注射KM 2周后,各频率ABR阈值较注射前上升幅度超过20dB,特别是在32 KHz时,其上升幅度超过了30dB。实验组(1)与实验组(2)耳蜗细胞病变类似,只是前者较后者严重。随着时间推移,SGCs密度逐渐降低,corti器结构尚存,但OHCs及IHCs均有不同程度的缺失,以OHCs为甚。结论：6-7周龄大鼠腹腔注射KM 400 mg/Kg per d 2周比较适合OECs移植。第三部分OECs对损伤SGCs保护和修复作用的研究目的：观察OECs移植对损伤大鼠SGCs的保护和修复作用。方法：将培养7d后的OECs进行核标记,以1×106个/ml密度悬浮,移植到腹腔注射KM 400 mg/Kg per d2周的实验组成年大鼠耳蜗内,对照组耳蜗注射等量的D-Hanks液,以ABR大鼠听力改变,HE染色和免疫荧光化学染色观察SGCs的密度及形态学改变。结果：对照组与实验组的ABR阈值在各频率无明显差异；实验组荧光显微镜下见大量Hoechst 33342标记的蓝色细胞核,分布在耳蜗底旋到顶旋；实验组SGCs密度与对照组有明显差异,大部分形态正常,核膜清晰,核中染色质清晰,核仁亦较清晰,排列尚紧密,少部分细胞核染色质边集,坏死,密度较正常大鼠SGCs明显降低；对照组SGCs大量坏死,部分细胞核结构被吞噬细胞吞噬,空泡化,细胞排列疏松、混乱,仅见少量正常的SGCs,免疫荧光见对照组有大量坏死细胞的碎片。结论：OECs可能促进SGCs的存活,对损伤大鼠SGCs有保护作用。

全文目录


中英文缩写对照  4-5
摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-12
第一部分 嗅鞘细胞培养、纯化、鉴定  12-19
  一 材料  13-14
    1. 实验动物  13
    2. 实验试剂  13
    3. 实验仪器  13-14
  二 方法  14-15
    1. OECs混合液的获取  14
    2. OECs的纯化培养  14
    3. OECs的标记  14
    4. 间接免疫细胞化学荧光染色  14-15
    5. OECs纯度统计  15
  三 结果  15-17
    1. 倒置显微镜下观察纯化培养的OECs  15
    2. 荧光显微镜下观察OECs及统计OECs的纯度  15-17
  四 讨论  17-19
第二部分 硫酸卡那霉素致SD大鼠听力下降模型立  19-30
  一 材料  20-21
    1. 实验动物  20
    2. 实验试剂  20
    3. 实验仪器  20-21
  二 方法  21-23
    1. 实验分组  21
    2. ABR检测大鼠听力阂值  21
    3. 组织学观察  21-23
      3.1 耳蜗冰冻切片制备  21-22
      3.2 耳蜗切片HE染色  22
      3.3 耳蜗免疫荧光染色  22
      3.4 耳蜗基底膜铺片  22-23
    4. 统计学分析  23
  三 结果  23-27
    1. KM提高大鼠ABR阈值  23-25
    2. KM损害耳蜗结构  25-26
    3. KM降低存活的SGCs密度  26-27
    4. KM减少耳蜗HCs数量  27
  四 讨论  27-30
第三部分 嗅鞘细胞促损伤SD大鼠螺旋神经节细胞保护和修复作用的研究  30-40
  一 材料  31-32
    1. 实验动物  31
    2. 实验试剂  31
    3. 实验仪器  31-32
  二 方法  32-33
    1. OECs培养、标记  32
    2. KM致大鼠中重度聋模型建立  32
    3. 标记的OECs移植到损伤大鼠耳蜗内  32-33
    4. 统计学分析  33
  三 结果  33-37
    1. 荧光标记OECs观察  33-34
    2. 大鼠ABR阂值的变化  34-35
    3. 大鼠耳蜗底圈SGCs形态的变化  35-36
    4. 大鼠耳蜗底圈SGCs密度变化  36-37
    5. 耳蜗其它细胞变化  37
  四 讨论  37-40
全文总结  40
本课题的创新和意义  40
展望  40-41
参考文献  41-48
主要试剂配制  48-49
综述  49-55
  参考文献  52-55
附录:硕士期间发表的文章  55-56
致谢  56-57

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中图分类: > 医药、卫生 > 耳鼻咽喉科学 > 耳科学、耳疾病
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