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TNBS诱导BALB/C小鼠慢性结肠炎动物模型的建立及其特点的研究

作　者: 戴萌
导　师: 李弼民
学　校: 南昌大学
专　业: 内科学
关键词: 三硝基苯磺酸急性结肠炎慢性结肠炎动物模型纤维化
分类号: R-332
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究背景:克罗恩病(Crohn’s disease,CD)患者的肠壁慢性炎症可导致肠道产生大量细胞外基质沉积,从而引起瘢痕收缩式狭窄。80%的患者在有生之年因不同程度的肠梗阻最终需要手术治疗,却无明显疗效。目前CD中肠道纤维化机制尚不明确且临床尚无有效的治疗方案,有关CD肠道纤维化的研究日益引起重视,迫切需要简单、有效、重复性好的类似于人类克罗恩病肠壁纤维化的动物模型。目的:探讨TNBS/酒精灌肠剂1周及6周灌肠诱导BALB/C小鼠分别构建急性结肠炎动物模型及伴随肠道纤维化的慢性结肠炎动物模型的可行性。分析结肠组织学变化及模型中各型胶原蛋白、TNF-α、TGF-β的表达水平,研究TNBS慢性结肠炎动物模型与TNBS急性结肠炎动物模型的不同,并探讨致肠壁纤维化可能的机制,寻求CD的治疗靶标。方法:将禁食24小时、不禁饮的BALB/C小鼠随机分成空白对照组、50%酒精对照组、TNBS急性结肠炎模型组、TNBS慢性结肠炎模型I组、TNBS慢性结肠炎模型II组,每组12只。空白对照组每周给予生理盐水100ul灌肠1次,50%酒精组每周给予给予50%酒精100ul灌肠1次,共灌肠6周后于第7周处死;TNBS急性模型组给予TNBS2.0mg/50%酒精100ul灌肠1周后,于第2周处死;TNBS慢性结肠炎模型组I、II组给予TNBS/50%酒精灌肠剂100ul,每周灌肠1次,灌肠剂中的TNBS剂量逐渐增加,共6周,分别于第7周,第9周处死小鼠。收集结肠组织标本,HE染色观察小鼠结肠组织炎症程度并评分,VG染色观察及用半定量标准判断小鼠结肠组织胶原蛋白增生程度,RT-PCR法检测小鼠结肠组织中各型胶原蛋白、TGF-β、TNF-αmRNA表达水平,免疫组化法检测小鼠结肠组织中TGF-β1、TNF-α蛋白的表达。结果:1. TNBS慢性结肠炎模型I、II组中BALB/C小鼠在灌肠后第一天起出现不同程度的症状,于第2、3天最为明显,于第3周达到顶峰,但在随后的4-6周,存活的小鼠逐渐稳定,且再无小鼠死亡。相对空白对照组及50%酒精对照组,三组模型组的DAI评分均增高(P<0.05),而TNBS慢性结肠炎模型I组、II组与TNBS急性结肠炎模型组相比DAI评分降低(P<0.05)。2.肉眼观察TNBS急性结肠炎模型小鼠结肠大体标本,可见病变结肠连续性水肿,透壁性坏死,以结肠末端为主,可涉及全结肠;TNBS慢性结肠炎模型小鼠见全结肠增长,病变结肠扭曲,僵硬,变形,部分肠段狭窄。病理观察TNBS急性结肠炎模型小鼠结肠可见严重肠道炎症表现,炎症评分较其他四组增高(P<0.05);TNBS慢性结肠炎动物动物模型I、II组小鼠可观察到结肠固有层炎症细胞浸润,上皮细胞破碎,杯状细胞减少,结肠粘膜下和浆膜层的区域显现出大量胶原蛋白沉淀,固有肌层明显增厚,偶可见纤维分隔,其炎症评分只较空白对照组增高(P<0.05),纤维化评分则较其余四组增高(P<0.05)。3. TNBS慢性结肠炎模型I、II组小鼠结肠组织中的Col-Iα2、Col-IIIα1、Col-Vα2 mRNA表达均较其余三组增高(P<0.05),TNBS急性、慢性结肠炎动物模型I、II组小鼠结肠组织中的TGF-β、TNF-αmRNA较其余两组表达增高(P<0.05),慢性结肠炎动物模型I、II组小鼠结肠组织中的TGF-βmRNA较急性结肠炎动物模型组增高(P<0.05)。4.与空白对照组、50%酒精对照组比较,三组模型组小鼠结肠组织中的TGF-β1蛋白表达均增高(P<0.05),但TNBS慢性结肠炎模型I、II组小鼠结肠组织中的TGF-β1蛋白较TNBS急性结肠炎模型组增高(P<0.05)。三组模型组小鼠结肠组织中的TNF-α蛋白较两最对照组表达明显增高(P<0.05),而三组间无明显统计学差异(P>0.05)。结论:1.通过对各组小鼠疾病活动指数、结肠大体标本及病理观察,说明TNBS可分别诱导急性结肠炎动物模型与伴随了肠壁纤维化的慢性结肠炎动物模型。2. TNBS急性结肠炎动物模型小鼠结肠病理特征以急性炎症为主,而TNBS慢性结肠炎模型小鼠结肠病理特征则以慢性炎症为主,结肠粘膜下和浆膜层的区域出现出大量胶原蛋白沉淀,固有肌层明显增厚,偶可见纤维分隔为特征。两模型的肠道炎症及纤维化特征与CD一致,因此分别体现CD的急性炎症期和慢性纤维化期。3. TNBS灌肠停止后,TNBS慢性结肠炎模型小鼠结肠组织中的肠道纤维化仍能持续至少2周以上。4. TNBS慢性结肠炎模型小鼠结肠组织中的肠道纤维化是由于机体对慢性损伤的修复反应过度所致,TGF-β1的过度表达在其纤维化进程中起重要作用,可作为CD肠道纤维化的治疗靶标。5. TNF-α于TNBS急性结肠炎动物模型、慢性结肠炎动物模型小鼠结肠组织中的持续高水平表达,可能是TNBS作为半抗原与体内蛋白结合成为抗原后产生免疫反应所致,或是TNF-α作为纤维化相关因素参与了慢性结肠炎模型小鼠的纤维化进程。提示TNF-α在模型小鼠肠道炎症及纤维化进程中的重要作用。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-13
第1章引言  13-15
第2章材料与方法  15-27
  2.1 材料  15-16
  2.2 实验方法  16-26
    2.2.1 主要溶液的配制  16-18
    2.2.2 动物模型的建立  18-19
    2.2.3 小鼠疾病活动指数（DAI）的评估  19
    2.2.4 标本采集和处理  19-20
    2.2.5 小鼠结肠组织的病理观察  20-21
    2.2.6 RT-PCR 检测结肠中各型胶原蛋白、TGF-β、TNF-αmRNA 的表达  21-25
    2.2.7 免疫组化检测结肠中TGF-β1、TNF-α蛋白的表达  25-26
  2.3 统计分析方法  26-27
第3章结果  27-36
  3.1 各组小鼠生存率及疾病活动指数（DAI）  27-29
  3.2 各组小鼠结肠大体及病理观察  29-31
  3.3 各组小鼠结肠中各型胶原蛋白、TGF-β、TNF-αm RNA 的表达水平  31-33
  3.4 各组小鼠结肠中TGF-β1、TNF-α蛋白的表达水平  33-36
第4章讨论  36-44
  4.1 常用的慢性结肠炎动物模型  36-37
  4.2 胶原蛋白与肠道纤维化  37-38
  4.3 TGF-β与IBD  38-39
  4.4 TNF-α与IBD  39-41
  4.5 重复TNBS/酒精灌肠致肠道纤维化可能的机制  41-42
  4.6 TNBS 急、慢性结肠炎动物模型的特点  42
  4.7 TNBS 慢性结肠炎动物模型的优点  42-44
第5章结论与展望  44-45
  5.1 结论  44
  5.2 展望  44-45
致谢  45-46
参考文献  46-49
附录  49-54
综述  54-64
攻读学位期间的研究成果  64

TNBS诱导BALB/C小鼠慢性结肠炎动物模型的建立及其特点的研究

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