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β-淀粉样蛋白和T淋巴细胞相互作用对神经元再生影响的初步研究

作　者: 郑嵋戈
导　师: 李国营
学　校: 广东药学院
专　业: 人体解剖与组织胚胎学;人体解剖与组织胚胎学
关键词: β-淀粉样蛋白 T淋巴细胞神经元再生
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景:阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease, AD)是一种最为常见的中枢神经系统退行性疾病,为痴呆的最主要分型。目前“Aβ假说”被广泛地接受为AD最主要的发病机理,即老年斑的主要组成成分——β-淀粉样蛋白(amyloid-β, Aβ)是AD发病进程的中心机制,其在特定脑区内聚集,引发相应的神经毒性作用,造成突触损伤,神经元死亡,从而导致了AD患者记忆衰退和认知功能障碍等相应症状的产生。Aβ的神经毒性能造成神经元死亡,但其对神经元再生的影响目前还不清楚。最近研究发现,中枢神经系统特异性的T淋巴细胞(CNS-specific T lymphocytes)在维持成体神经元再生和空间学习记忆能力中起重要作用。很多研究也表明T淋巴细胞参与AD的病理过程,并且其在AD脑内的数目明显增加,但迁移入脑的T细胞(infiltrating T lymphocytes)在AD中的作用目前仍不清楚。为进一步研究和证实在AD发生中Aβ和T淋巴细胞的作用,本课题拟从神经元再生的角度入手,提出如下假说:(1)AD中,Aβ不仅能诱导神经元的死亡,还能抑制神经元的再生,从而造成脑内神经元大量丢失和供给不足,最终导致AD的发生;(2)Aβ抑制神经元再生的毒性效应可能与抑制T淋巴细胞的促神经元再生作用有关,如抑制其关键效应因子的表达;(3)T淋巴细胞能促进Aβ的清除,改善脑内神经发生区域的内环境,维持神经元的再生,从而延缓AD病情。为证实本课题提出的假设,为AD研究提供新的思路和方法,课题设计如下:研究方法:1.利用Aβ-intrahippocampal injection的方法,向实验小鼠脑内海马部位注射寡聚态Aβ1-42,使其在脑内沉积,以模拟AD的主要病理特征,制备动物模型。分野生型组(BALB/c-WT)和T淋巴细胞缺陷型组(BALB/c-nude),实验组注射寡聚态Aβ1-42(每只小鼠每侧海马注射4μg/2μl),对照组注射等体积无菌生理盐水(NS)。分术后第7天、14天和21天三个时间点取材。2.常规HE染色,比较Aβ1-42组和NS组之间的差异。3.利用Brdu和DCX双重标记,检测各组海马内神经元的再生情况。4.利用免疫组织化学方法检测各实验组脑内Aβ1-42的沉积,比较WT组和nude组在各时间点小鼠脑内Aβ1-42沉积量的变化。5.利用Western blot检测IFN-γ、NF-κB在各组海马内的表达。研究结果:1.与NS对照组相比, Aβ1-42实验组注射后的炎症损伤区域明显扩大,Aβ1-42-injection引发神经元变性。2. BrdU标记显示,Aβ1-42-injection组和NS-injection组小鼠脑内海马齿状回的亚颗粒细胞层(SGZ)和注射创伤部位均有新生细胞产生。BrdU/DCX双标显示,阳性细胞即新生的神经元主要集中在海马齿状回的亚颗粒细胞层;与NS-injection组相比,Aβ1-42-injection组双标阳性细胞明显减少,差异极显著(P<0.01);BALB/c-WT组明显多于BALB/c-nude组,有极显著性差异(P<0.01)。3.实验组中Aβ1-42阳性斑块主要沉积于海马结构和皮质区。在BALB/c-WT小鼠脑内,Aβ1-42的沉积,随时间的推移——由术后第7天至第21天,逐渐减少。而在BALB/c-nude小鼠脑内,Aβ1-42沉积在三个时间点的变化并不显著。尤其是在术后第三个时间检测点,两组差异尤为明显,BALB/c-WT组小鼠脑内Aβ1-42的残余比BALB/c-nude组明显减少。4. Western blot检测显示,效应因子INF-γ和NF-κB在BALB/c-WT组小鼠海马内有阳性表达,而在BALB/c-nude组中含量低于检出水平或是不表达。在BALB/c-WT小鼠中,与NS-injection组相比,Aβ1-42-injection组INF-γ、NF-κB的表达明显减少,差异极显著(P<0.01)。结论:1. Aβ1-42能显著抑制神经元的再生,这种毒性效应可能与海马内INF-γ、NF-κB的表达下调有关。2. T淋巴细胞参与Aβ1-42清除过程,缺乏T淋巴细胞脑内Aβ1-42的清除作用减弱。3. T淋巴细胞促神经元再生作用的发挥,可能与其分泌的关键效应因子INF-γ,以及海马内NF-κB的表达调节有关。

全文目录

摘要  6-9
Abstract  9-12
序言  12-15
材料与方法  15-22
  1 实验材料  15-18
    1.1 主要仪器及试剂  15-18
      1.1.1 仪器  15-16
      1.1.2 试剂  16-18
    1.2 实验动物  18
  2 实验方法  18-22
    2.1 Aβ-intrahippocampal injection 动物模型的建立  18-19
      2.1.1 Aβ1-42 的孵育  18-19
      2.1.2 Aβ-intrahippocampal injection 动物模型的制备  19
      2.1.3 BrdU 的注射  19
    2.2 动物的取材处理  19
    2.3 组织形态学检测  19-21
      2.3.1 组织块石蜡包埋和切片制作  19-20
      2.3.2 苏木素-伊红染色（HE 染色）  20
      2.3.3 免疫组织化学检测（SABC 法）  20-21
      2.3.4 统计学方法  21
    2.4 蛋白印迹检测  21-22
      2.4.1 蛋白质的提取  21
      2.4.2 蛋白质定量  21-22
      2.4.3 Western Blot  22
结果  22-31
  1 组织形态学检测结果与分析  22-30
    1.1 Aβ1-42-injection & NS-injection 的影响比较  22-24
    1.2 Aβ-intrahippocampal injection 对神经细胞再生的影响  24-28
      1.2.1 BrdU 标记各组小鼠脑内的新生细胞  24-26
      1.2.2 BrdU/DCX 双标检测各组神经元的再生情况  26-28
    1.3 β-淀粉样蛋白在各组脑内的沉积变化  28-30
  2 Western blot 检测结果与分析  30-31
讨论  31-35
  1 β-淀粉样蛋白对神经元再生的影响  31-33
  2 T 淋巴细胞在AD 中的作用  33-34
  3 β-淀粉样蛋白和T 淋巴细胞之间的相互作用  34-35
结论  35
参考文献  35-42
中英文缩写语对照表  42-43
综述  43-56
  参考文献  49-56
攻读学位期间发表的文章  56-57
致谢  57

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