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天冬酰胺合成酶B体外筛选模型的构建与应用

作　者: 于丹
导　师: 向文胜
学　校: 东北农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 天冬酰胺合成酶B 蛋白纯化体外筛选模型模型应用
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

天冬酰胺合成酶B(AS-B)是一个广泛存在于植物和微生物体内催化天冬酰胺合成的关键性酶,已经证实为除草剂环庚草醚的靶标酶。本研究构建了AS-B的原核表达载体,用大肠杆菌表达系统表达了AS-B,并对其进行了纯化及活性测定。使用已知除草剂环庚草醚及1, 4-桉树脑对所构建的筛选模型进行了验证,并应用此模型对本实验室筛选得到的四株放线菌的发酵产物进行筛选。主要研究结果如下:(1)将本研究克隆得到的大豆AS-B基因按正确阅读框克隆到原核表达载体pET30a (+),并转化至大肠杆菌Rosetta (DE3) pLysS,对诱导剂浓度、诱导时间进行了摸索,获得蛋白的最佳表达条件。结果表明,当IPTG终浓度为0.5 mM,于16℃下诱导培养14 h时目的蛋白表达量最高,约60%的目的蛋白以可溶性形式存在。(2)将获得的可溶性AS-B在4℃条件下用镍柱纯化去除杂蛋白,再经LH-20葡聚糖凝胶柱脱盐,最终可获得纯度大于90%的AS-B。使用高效液相色谱法对酶活性进行测定,当以Gln和NH4Cl为氮源时,测得酶比活值分别为2.32μmol/min﹒mg与2.6μmol/min﹒mg。(3)用已知靶标除草剂环庚草醚和化合物1, 4-桉树脑对此筛选模型进行验证,结果表明1, 4-桉树脑可以抑制AS-B的活性,其I50值为0.03μg/mL,而环庚草醚对AS-B活性没有明显抑制,这与文献报道相符,证明已成功构建AS-B体外筛选模型。(4)应用此筛选模型对本实验室筛选到的四株放线菌的发酵产物进行筛选,结果显示1号放线菌的代谢产物对AS-B的活性有抑制作用,且上清液比菌体浸提液对其的抑制作用更强。经16S rDNA鉴定,该放线菌属于链霉菌属。

天冬酰胺合成酶B体外筛选模型的构建与应用

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