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狗舌草中黄酮类和生物碱类活性成分的提取分离工艺研究

作　者: 邱燕燕
导　师: 牛泱平
学　校: 浙江工业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 狗舌草提取和纯化工艺总黄酮总生物碱乙醇提取物抗白血病作用
分类号: TQ461
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

狗舌草为菊科植物狗舌草的全草,多年生草本,广布于我国北部、东北部及华东、西南各地,可全草入药,具有清热解毒、活血消肿、解痉抗溃疡等作用。近年来有研究报道:狗舌草60%乙醇提取物（主要含有水醇兼容性生物碱和黄酮类化合物）对小鼠淋巴性白血病L1210细胞有较强的抑制作用,另据中药大辞典记载“3g/ml的狗舌草对白血病细胞有抑制作用”,但目前国内外对狗舌草中抗白血病有效成分的研究报道不多,有关狗舌草中有效成分提取纯化工艺研究的资料也甚少。本研究以狗舌草为原料,在前期药理实验的基础上,对狗舌草中总黄酮和生物碱类化合物进行提取、分离纯化工艺研究,并对其化学成分进行了定性和定量测定,为进一步分离狗舌草中黄酮和生物碱化合物提供理论基础。第一部分:狗舌草乙醇提取物的药理活性研究腹腔注射给药考察狗舌草乙醇提取物（30%、60%、95%）对L1210荷瘤小鼠的体重变化情况、平均存活天数、生命延长率及腹围的影响。结果显示狗舌草60%、95%乙醇提取物的抗白血病效果相对较好,考虑到节省溶剂问题,选用60%的乙醇作为提取溶剂。第二部分:狗舌草活性组分的提取工艺优化采用单因素和正交试验相结合的方法,对提取时间、提取温度、提取次数、料液比4个因素进行研究,优化了狗舌草中总黄酮和总生物碱的提取工艺并进行了定性、定量试验。狗舌草总黄酮的最佳提取工艺:提取温度80℃,料液比1:10,提取时间3h,提取次数2次。最优提取工艺条件下的总黄酮提取率为0.523%,比色法测得总黄酮含量为6.897%。狗舌草总生物碱的最佳提取工艺:提取温度80℃,料液比1:10,提取时间3h,提取次数3次。最优提取工艺条件下的总生物碱平均提取率为0.211%。第三部分:狗舌草总黄酮的分离纯化工艺优化采用D101型大孔吸附树脂对狗舌草总黄酮进行了纯化。考察静置吸附时间、上样液浓度、上样液pH值、上样流速、洗脱剂体积分数、洗脱剂体积、洗脱流速等条件对纯化效果的影响;得较佳的吸附条件为:静置吸附时间为24h,上样液浓度为0.5mg/mL,上样液pH值为6-8,上样液加样流速为2BV·h^-1;较佳的洗脱条件为:洗脱剂选用体积分数为70%乙醇,洗脱液pH值为6-8,洗脱剂体积为2.5BV,洗脱流速为2BV·h^-1。经D101大孔树脂处理后的狗舌草总黄酮纯度是原来的2.3倍。第四部分:狗舌草中黄酮类化合物的初步分离利用硅胶以及凝胶柱对狗舌草乙酸乙酯萃取部分（总黄酮部分）进行了初步分离,并运用现代波谱技术对分离得到的化合物进行了结构鉴定。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-15
第一章文献综述  15-29
  1.1 天然药物研究进展综述  15-24
    1.1.1 天然药物概述  15
    1.1.2 天然药效成分的提取方法  15-18
      1.1.2.1 热水提取法  16
      1.1.2.2 溶剂提取法  16
      1.1.2.3 超声波提取法  16-17
      1.1.2.4 微波提取法  17
      1.1.2.5 酶法提取  17-18
      1.1.2.6 超临界流体萃取法  18
    1.1.3 天然药效成分的分离纯化方法  18-21
      1.1.3.1 系统溶剂分离法  18-19
      1.1.3.2 两相溶剂萃取法  19
      1.1.3.3 沉淀法  19
      1.1.3.4 结晶法  19
      1.1.3.5 吸附色谱法  19-20
      1.1.3.6 凝胶色谱法  20
      1.1.3.7 大孔吸附树脂法  20-21
    1.1.4 天然药效成分的抗癌活性研究  21-24
      1.1.4.1 生物碱类  22
      1.1.4.2 黄酮类  22-23
      1.1.4.3 挥发油  23
      1.1.4.4 多糖类  23
      1.1.4.5 有机酸类  23
      1.1.4.6 甙类  23-24
      1.1.4.7 其他类  24
  1.2 狗舌草研究进展综述  24-27
    1.2.1 狗舌草简介  24-25
    1.2.2 狗舌草药理作用  25-27
  1.3 研究目的和意义  27-28
  1.4 本研究的主要内容  28-29
第二章狗舌草乙醇提取物的药理活性研究  29-37
  2.1 前言  29-30
  2.2 主要药物和试剂  30
  2.3 实验仪器  30-31
  2.4 实验方法  31-32
    2.4.1 细胞培养和冻存  31
    2.4.2 药液制备  31
    2.4.3 L1210小鼠白血病模型的建立  31-32
      2.4.3.1 L1210白血病细胞株的复苏与培养  31-32
      2.4.3.2 L1210接种液的制备  32
      2.4.3.3 细胞计数  32
      2.4.3.4 接种  32
      2.4.3.5 动物分组与给药  32
  2.5 结果与分析  32-34
    2.5.1 L1210荷瘤小鼠一般情况  32-33
    2.5.2 狗舌草乙醇提取物对L1210荷瘤小鼠体重变化影响  33
    2.5.3 狗舌草乙醇提取物对L1210荷瘤小鼠平均存活天数及生命延长率的影响  33
    2.5.4 狗舌草乙醇提取物对L1210荷瘤小鼠腹围的影响  33-34
  2.6 讨论  34-35
  2.7 本章小结  35-37
第三章狗舌草活性组分的提取工艺优化  37-54
  3.1 前言  37
  3.2 主要药物和试剂  37
  3.3 实验仪器  37-38
  3.4 实验方法  38-41
    3.4.1 热回流法  38
    3.4.2 单因素试验  38-39
    3.4.3 正交设计试验  39
    3.4.4 狗舌草中黄酮成分的测定  39-40
      3.4.4.1 总黄酮定性试验(显色反应)  39-40
      3.4.4.2 总黄酮的定量测定(比色法)  40
    3.4.5 狗舌草中生物碱成分的测定  40-41
  3.5 结果与分析  41-52
    3.5.1 单因素试验结果  41-44
      3.5.1.1 提取时间对提取率的影响  41-42
      3.5.1.2 提取温度对提取率的影响  42
      3.5.1.3 提取次数对提取率的影响  42-43
      3.5.1.4 料液比对提取率的影响  43-44
    3.5.2 正交试验结果  44-49
      3.5.2.1 狗舌草中黄酮类化合物的工艺优化结果  45-48
      3.5.2.2 狗舌草中生物碱类化合物的工艺优化结果  48-49
    3.5.3 狗舌草提取物中总黄酮的测定结果  49-52
      3.5.3.1 总黄酮定性试验结果  49
      3.5.3.2 总黄酮定量测定结果  49-50
      3.5.3.3 方法学考察  50-52
    3.5.4 狗舌草提取物中总生物碱鉴定结果  52
  3.6 讨论  52-53
  3.7 本章小结  53-54
第四章狗舌草总黄酮的分离纯化工艺优化  54-66
  4.1 前言  54-55
  4.2 实验材料与设备  55
  4.3 实验方法  55-58
    4.3.1 狗舌草总黄酮粗品的制备  55
    4.3.2 大孔吸附树脂的预处理和再生  55-56
      4.3.2.1 预处理  55-56
      4.3.2.2 再生  56
    4.3.3 狗舌草总黄酮的静态吸附与解吸实验  56-57
      4.3.3.1 不同吸附时间对狗舌草总黄酮吸附效果的影响  56
      4.3.3.2 不同狗舌草黄酮浓度对狗舌草总黄酮吸附效果的影响  56-57
      4.3.3.3 不同pH值对狗舌草总黄酮吸附效果的影响  57
      4.3.3.4 不同浓度解吸液对狗舌草总黄酮解吸效果的影响  57
      4.3.3.5 不同pH值解吸液对狗舌草总黄酮解吸效果的影响  57
    4.3.4 狗舌草总黄酮动态吸附与解吸实验  57-58
      4.3.4.1 不同吸附流速对狗舌草总黄酮吸附效果的影响  57
      4.3.4.2 不同洗脱剂体积对狗舌草总黄酮洗脱效果的影响  57-58
      4.3.4.3 不同洗脱速度对狗舌草总黄酮洗脱效果的影响  58
  4.4 结果与分析  58-64
    4.4.1 狗舌草总黄酮静态吸附与解吸实验结果  58-62
      4.4.1.1 不同吸附时间对狗舌草总黄酮吸附效果实验结果  58-59
      4.4.1.2 不同狗舌草黄酮浓度对狗舌草总黄酮吸附实验结果  59
      4.4.1.3 不同pH值对狗舌草总黄酮吸附效果实验结果  59-60
      4.4.1.4 不同浓度解吸液对狗舌草总黄酮解吸效果实验结果  60-61
      4.4.1.5 不同pH值解吸液对狗舌草总黄酮解吸效果的影响  61-62
    4.4.2 狗舌草总黄酮动态吸附与解吸实验结果  62-64
      4.4.2.1 不同吸附流速对狗舌草总黄酮洗脱效果实验结果  62
      4.4.2.2 不同洗脱液体积对狗舌草总黄酮洗脱效果实验结果  62-63
      4.4.2.3 不同洗脱速度对狗舌草总黄酮洗脱效果实验结果  63-64
    4.4.3 验证实验  64
  4.5 讨论  64-65
  4.6 本章小结  65-66
第五章狗舌草中黄酮类化合物的初步分离  66-78
  5.1 前言  66
  5.2 实验所用的仪器和化学试剂  66
  5.3 实验方法  66-69
    5.3.1 提取  66
    5.3.2 总黄酮萃取部分的分离  66-69
  5.4 结果与分析  69-77
    5.4.1 化合物结构鉴定  69-77
      5.4.1.1 化合物Ⅰ  69-71
      5.4.1.2 化合物Ⅱ  71-73
      5.4.1.3 化合物Ⅲ  73-75
      5.4.1.4 化合物Ⅳ  75-76
      5.4.1.5 化合物Ⅴ  76-77
  5.5 讨论  77-78
第六章结论  78-79
参考文献  79-87
致谢  87-88
硕士期间论文发表情况  88

狗舌草中黄酮类和生物碱类活性成分的提取分离工艺研究

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