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DEK蛋白的表达和纯化及其功能的初步研究

作　者: 华颖
导　师: 洪涛
学　校: 北京交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: DEK蛋白 表达 纯化 DNA结合活性 细胞增殖 细胞凋亡
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 74次
引　用: 1次
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内容摘要


DEK蛋白是一种含量丰富、普遍存在的可磷酸化的染色质架构蛋白,主要存在于细胞核的常染色质中,由375个氨基酸组成。DEK蛋白有两个功能性的DNA结合域,一个是位于中心的SAP/SAF DNA结合域,一个是位于C末端的DNA结合域（简写为CDB）。CDB是近年新发现的一个DEK蛋白与DNA的结合域,其中存在多个磷酸化位点,与DEK蛋白的功能密切相关。DEK蛋白在一些自身免疫性疾病和人类恶性肿瘤中呈过表达,而在某些恶性肿瘤中DEK蛋白低表达。但DEK蛋白在细胞中的功能目前仍不明了,越来越多的研究数据表明,DEK蛋白与细胞凋亡存在一定的关系。根据文献报道的上述研究结果,我们推测CDB可能在DEK蛋白在细胞中功能的发挥上具有较为重要的作用。本研究以对CDB的研究为切入点,以期为进一步阐明DEK蛋白功能的研究提供线索。首先,以宫颈癌细胞HeLa细胞cDNA为模板,构建了含有目的基因DEK的质粒pMD18-T-DEK及原核表达质粒pET-30a（+）-CDB,用E.coli BL21（DE3）菌株进行了融合蛋白His-CDB的原核表达及纯化,并研究了其与DNA的结合活性。结果显示,获得了高纯度的融合蛋白His-CDB。复性的融合蛋白His-CDB与DNA结合活性的凝胶迁移阻滞分析结果提示,CDB可与超螺旋型及线性化的DNA结合,但更倾向于与超螺旋型DNA相结合,同全长DEK蛋白具有相类似的特点。之后,我们构建了分别含有全长DEK、含有核定位序列的CDB、CDB及荧光蛋白基因的真核表达质粒,用转染的方法在真核细胞HeLa细胞中分别过表达目的蛋白,在不同的时间点用CCK-8检测细胞的增殖活性及用Caspase-Glo?3/7 Assay检测细胞凋亡情况,初步的研究结果显示,上述三种目的蛋白的过表达对细胞的增殖有促进作用,对细胞凋亡可能有间接的促进作用。但这一结论还需进一步的实验来验证。最后,我们用Western blotting的方法检测了Hela、A549、U251、293、Fibroblast（原代培养传代至第六代）、SH-SY5Y六种细胞株中的DEK蛋白的表达水平,以GAPDH为内参,在内参基本一致的情况下,六种细胞株的DEK蛋白表达水平不同。同为肿瘤细胞株的A549 DEK蛋白表达水平较低,成纤维细胞（来源于健康成年人）原代培养传代至第6代的细胞及其它4种细胞株的DEK蛋白表达水平较高,其mRNA水平是否存在差异及可能的表达调节机制需进一步的研究来探讨。综上所述,本研究首次用原核表达并纯化了CDB并研究了其与DNA的结合活性,继而在细胞水平研究了全长DEK、含有核定位序列的CDB、CDB的过表达对细胞增殖及凋亡的影响,为有关DEK蛋白功能的研究提供新的思路。

全文目录


致谢  5-6
中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
1 引言  13-19
  1.1 研究DEK蛋白的意义和必要性  13
  1.2 DEK蛋白的分布、含量及结构特征  13-14
  1.3 DEK蛋白的国内外研究现状和发展趋势  14-16
    1.3.1 DEK蛋白的国内外研究现状  14-15
    1.3.2 DEK蛋白研究的发展趋势——DEK蛋白与细胞凋亡密切相关  15-16
  1.4 研究目的和内容  16-17
    1.4.1 研究目的  16
    1.4.2 研究内容  16-17
  1.5 技术路线  17-18
  1.6 研究意义  18-19
2 CDB的原核表达和纯化及其与DNA的结合活性  19-41
  2.1 实验材料  19-20
    2.1.1 细胞株及细胞培养所用试剂  19
    2.1.2 细菌菌株及细菌培养所用试剂及培养基  19
    2.1.3 质粒  19-20
    2.1.4 试剂与试剂盒  20
  2.2 方法  20-35
    2.2.1 全长DEK基因的体外扩增和pMD18-T-DEK的构建  20-25
    2.2.2 CDB的原核表达及纯化  25-32
    2.2.3 CDB与DNA的结合活性研究  32-35
  2.3 结果  35-40
    2.3.1 全长DEK基因的体外扩增和pMD18-T-DEK的构建  35-36
    2.3.2 CDB的原核表达及纯化  36-39
    2.3.3 CDB与DNA的结合活性研究  39-40
  2.4 讨论  40-41
3 DEK蛋白全长和片段的真核表达及其对细胞增殖活性及凋亡的影响  41-52
  3.1 实验材料  41-42
    3.1.1 细胞株及细胞培养所用试剂  41
    3.1.2 细菌菌株及细菌培养所用试剂及培养基  41
    3.1.3 质粒  41-42
    3.1.4 试剂与试剂盒  42
  3.2 方法  42-46
    3.2.1 质粒的构建及提取  42-45
    3.2.2 真核细胞的转染  45
    3.2.3 细胞的增殖活性检测及细胞凋亡检测  45-46
  3.3 结果  46-49
    3.3.1 质粒的构建及提取  46-47
    3.3.2 真核细胞的转染  47-48
    3.3.3 细胞的增殖活性检测及细胞凋亡检测  48-49
  3.4 讨论  49-52
4 DEK蛋白在几种真核细胞株中的表达水平检测  52-56
  4.1 实验材料  52
    4.1.1 细胞株及细胞培养所用试剂  52
    4.1.2 试剂与试剂盒  52
  4.2 方法  52-53
    4.2.1 细胞培养及传代  52
    4.2.2 细胞的超声破碎  52-53
    4.2.3 细胞的DEK蛋白表达水平检测  53
  4.3 结果  53-54
    4.3.1 细胞培养及传代  53
    4.3.2 细胞的超声破碎  53-54
    4.3.3 细胞的DEK蛋白表达水平检测  54
  4.4 讨论  54-56
5 结论  56-57
参考文献  57-60
附录  60-68
作者简历  68-70
学位论文数据集  70

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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