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SIgA分泌片的原核表达及抗分泌片单克隆抗体的制备

作　者: 陈斌
导　师: 何后军；童贻刚
学　校: 江西农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 分泌片 原核表达 单克隆抗体 SIgA
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


分泌型IgA是人体合成分泌最多的免疫球蛋白,主要存在于泪液、唾液、初乳、胃肠液等外分泌液中,是粘膜局部免疫的最重要因素。分泌型IgA主要由黏膜中的IgA浆细胞分泌,受神经、内分泌、和免疫系统的调节,能够抑制细菌黏附黏膜表面,中和肠道内的毒素、酶和病毒,降低病毒与黏膜的接触,另外对肠道菌群中的革兰氏阴性杆菌具有特殊的亲和力,同时具有对嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒作用和ADCC作用。本研究通过基因工程技术克隆分泌片基因,表达分泌片蛋白,将其制备成单克隆抗体,为建立检测SIgA试剂盒奠定基础。以真核表达质粒为模板,通过PCR扩增出SC基因,将SC基因克隆到原核表达载体PQE80L中,将其转化入大肠杆菌T1, PCR和双酶切鉴定转化菌落,再将质粒转入表达感受态BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE分析靶蛋白的表达,用Ni-NTA柱亲和层析法纯化目的蛋白。用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定效价,然后与SP2/0瘤细胞融合,经过亚克隆筛选,得到抗SC的单克隆抗体,Western Blot检测抗体。本研究扩增了SC基因,成功构建了其原核表达质粒pQE80L-SC, SDS-PAGE分析蛋白大小为70kd,与理论值一致。使用纯化后的蛋白免疫小鼠,得到高效价的多克隆血清,将小鼠脾细胞与SP2/0瘤细胞融合,筛选到2株分泌单克隆抗体的细胞株。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章 SIgA的研究进展  7-13
  1.1 SIgA的结构及其组成成分  7-8
  1.2 SIgA的功能和作用  8-9
  1.3 SIgA与疾病的关系  9-11
    1.3.1 呼吸道和胃肠道疾病  9-10
    1.3.2 泌尿生殖系统疾病  10
    1.3.3 肝胆疾病  10
    1.3.4 癌症  10
    1.3.5 其它疾病  10-11
  1.4 SC在SIgA中的作用  11-12
    1.4.1 SC与疾病的关系  11-12
  1.5 本试验研究的背景和目的意义  12-13
第二章 SC基因克隆构建及表达  13-24
  2.1 材料  13-14
    2.1.1 质粒及菌株  13
    2.1.2 寡核苷酸引物  13
    2.1.3 主要试剂  13
    2.1.4 主要仪器设备  13
    2.1.5 培养基及溶液  13-14
  2.2 方法  14-19
    2.2.1 PCR方法扩增SC基因  14-15
    2.2.2 重组pQE80L-SC质粒的构建  15-16
    2.2.3 重组pQE80L-SC质粒的鉴定  16-17
    2.2.4 重组质粒pQE80L-SC在BL21(DE3)中的表达  17
    2.2.5 SDS-PAGE分析  17-18
    2.2.6 重组蛋白表达形式分析  18
    2.2.7 包涵体的纯化回收  18-19
  2.3 结果  19-23
    2.3.1 PCR扩增SC基因  19
    2.3.2 SC基因的测序结果  19-20
    2.3.3 重组pQE80-SC质粒的PCR鉴定  20-21
    2.3.4 对阳性克隆的酶切鉴定  21
    2.3.5 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达形式和溶解性分析  21-22
    2.3.6 不同浓度尿素溶解分析  22
    2.3.7 SC的纯化分析  22-23
  2.3 讨论  23-24
第三章 抗SC单克隆抗体的制备  24-34
  3.1 材料  24
    3.1.1 实验材料  24
    3.1.2 实验试剂  24
    3.1.3 主要仪器设备  24
  3.2 方法  24-30
    3.2.1 免疫小鼠  24-25
    3.2.2 间接ELISA建立  25
    3.2.3 骨髓瘤细胞的培养  25-26
    3.2.4 饲养细胞的制备  26
    3.2.5 脾细胞与瘤细胞的融合  26-27
    3.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆  27-28
    3.2.7 杂交瘤细胞的冻存与复苏  28
    3.2.8 单克隆抗体的制备  28
    3.2.9 Western blot实验  28-29
    3.2.10 单克隆抗体分型鉴定  29
    3.2.11 单克隆抗体的纯化  29-30
  3.3 结果  30-33
    3.3.1 小鼠免疫的效价图  30
    3.3.2 饲养细胞的细胞形态  30
    3.3.3 杂交瘤细胞的细胞形态  30-31
    3.3.4 Western Blot检测抗体  31-32
    3.3.5 单克隆抗体免疫球蛋白类及亚类的鉴定  32
    3.3.6 单克隆抗体分子量SDS-PAGE鉴定  32-33
  3.4 讨论  33-34
全文结论  34-35
参考文献  35-38
附录  38-41
致谢  41-42
作者简介  42

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜免疫学
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