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创伤弧菌消杀抗性及其菌体抗原、溶细胞毒素蛋白抗原主动免疫的动物实验研究

作　者: 王贵明
导　师: 申洪
学　校: 南方医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 创伤弧菌溶细胞毒素蛋白主动免疫菌体抗原蛋白抗原抗体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 55次
引　用: 2次
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内容摘要

研究背景和目的创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)是弧菌属第5群细菌,根据其生化特性、流行病学模式以及宿主范围将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个亚型,其中Ⅰ型Vv是导致人群创伤感染及原发性败血症的病原体。原发性创伤弧菌感染发病率呈逐年递增的趋势。目前世界上大部分沿海国家都有创伤弧菌感染的病例报告。我国国内1990年报道首例,随后沿海各地区每年都有散发病例报道,其病死率一直居高不下。对本病的认识不足,发病早期未能正确诊断,或误诊为药物超敏反应而使用大剂量激素,是造成高病死率的主要原因。创伤弧菌的感染途径有二:一是经口感染,二是通过皮肤伤口侵入。创伤弧菌感染一旦出现败血症,其死亡率高达50%以上。那么,我们能否采取措施避免接触到创伤弧菌呢?在不可避免接触到创伤弧菌的情况下,我们能否通过机体主动免疫的方法避免其感染乃至致病呢?为此,我们设计了本课题,试图通过体外及主动免疫动物实验来回答上述问题。方法1.创伤弧菌的生化特性及抗性研究:1.1取新鲜培养的创伤弧菌接种于弧菌属生化鉴定管及生化条培养24h后,目测或上机读取鉴定结果。1.2紫外线抗性:创伤弧菌ATCC27562、大肠杆菌ATCC25922悬液及平板在强度值达90μW/cm~2的紫外线照射不同时间后,培养并定量测试照射前后的活菌浓度,统计杀菌率,绘制照射前后灭活曲线(t-Δlg)。1.3 3种消毒剂抗性:戊二醛、过氧乙酸及乙醇以无菌去离子水1:2等比系列稀释至1:256后作用于创伤弧菌,培养24h观察细菌生长情况,确定其对创伤弧菌的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC);20g/L戊二醛、5g/L过氧乙酸及75%乙醇作用于创伤弧菌10s、20s、30s、60s、90s及120s,培养24h后观察细菌生长情况,确定其对创伤弧菌的最快杀菌时效。2.创伤弧菌主动免疫预防的动物实验研究2.1创伤弧菌溶细胞毒素的提取、纯化及鉴定重组大肠杆菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21(DE3)恢复培养,行蓝白斑筛选,挑取白色菌斑进行PCR扩增并琼脂糖电泳验证目的基因存在。挑选阳性克隆并以最佳诱导条件进行诱导培养,离心收集细菌,超声破菌,离心后上清液经过His-Bind亲和层析方法纯化重组创伤弧菌溶细胞毒素(rVVC)并行SDS-PAGE电泳及Western-blot验证。纯化后的蛋白以透析法进行复性和浓缩。采用BCA(bicinchoninicacid)法进行蛋白定量,绘制标准曲线,计算出蛋白浓度。2.2创伤弧菌主动免疫预防的动物实验研究(1)实验动物及分组:SPF级BALB/c小鼠54只,雌雄不拘,随机分为创伤弧菌菌体抗原组(简称菌体抗原组)、溶细胞毒素蛋白抗原组(简称蛋白抗原组)、生理盐水对照组(简称对照组)各18只。(2)抗原制备:创伤弧菌菌体抗原,新鲜培养的创伤弧菌以0.3%甲醛灭活24h,无菌试验合格后4℃保存;创伤弧菌溶细胞毒素蛋白抗原,rVVC与完全弗氏佐剂/不完全弗氏佐剂等体积乳化制成。(3)免疫方案:小鼠皮下多点注射,创伤弧菌菌体抗原组小鼠接种菌体抗原:1×10~8个/只/次;溶细胞毒素蛋白抗原组小鼠接种蛋白抗原50μg/只/次;生理盐水对照组小鼠接种生理盐水:0.2ml/只/次,0d、首次免疫14d后每10d加强一次。(4)小鼠免疫学指标:免疫接种3-6次后,每组3只小鼠取外周血行流式细胞术检测小鼠外周血中淋巴细胞亚群比例;每组6只小鼠,取脾及胸腺,称重,MTT法检测脾淋巴细胞转化率;血清凝集试验及间接ELISA法检测特异性抗体及IgG效价。(5)创伤弧菌攻击试验:3组小鼠按上述方法免疫接种6次后,12只/组,75%酒精棉球消毒右下腹皮肤后腹腔注射新鲜培养创伤弧菌ATCC27562悬液,0.5ml/只,细菌浓度约为10~7-10~8cfu/ml。监测所有小鼠一般情况,包括呼吸、精神状态、毛发、体温等。小鼠死亡后立即解剖,存活小鼠于注射活菌后48h或10d断椎法处死,取其主要脏器及组织固定、石蜡包埋后按常规方法制片、HE染色,光镜下观察其病理变化。同时取心脏内血液或血凝块进行Vv分离培养及生化鉴定。结果1.创伤弧菌抗性实验1.1创伤弧菌ATCC27562生化特性符合创伤弧菌的生化鉴别特征,生化条鉴定结果:创伤弧菌%id=99.9(机读结果显示为“非常好的鉴定结果”)。1.2创伤弧菌紫外线抗性研究创伤弧菌ATCC27562在强度值达90μW/cm~2的紫外线照射,15min后定性培养为阴性,定量检测1min平均灭活对数值(LIV)悬液法为4.37±0.13、平板法为5.10±0.19,平均杀菌率悬液法为(99.99±0.01)%、平板法为(99.99±0.05)%,照射15min后无菌存活。1.3创伤弧菌对3种消毒剂抗性研究戊二醛对创伤弧菌的MIC为0.31g/L,MBC为10.00g/L;过氧乙酸对创伤弧菌的MIC为0.04g/L,MBC为0.31g/L;乙醇对创伤弧菌的MIC为4.69%,MBC为37.50%。20g/L戊二醛作用10s、5g/L过氧乙酸作用10s、75%乙醇作用60s均能有效杀灭创伤弧菌。2.创伤弧菌主动免疫预防动物实验2.1创伤弧菌溶细胞毒素的表达、提取、纯化及鉴定蓝白斑筛选LB平板上长有白色及蓝色的单克隆细菌斑,其中白色菌落为带重组质粒的细菌,即阳性克隆。挑取白色菌斑培养,进行质粒提取,并以其为模板进行PCR扩增vvhA基因,琼脂糖电泳获得相应大小目的条带(vvhA:1356bp)。SDS-PAGE电泳显示阳性克隆重组大肠杆菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导培养,能表达融合蛋白rVVC,在凝胶上70KD的位置可见相应蛋白条带。rVVC经透析复性、浓缩后,BCA法测定蛋白浓度为2.542mg/ml。Western-blot免疫印迹实验结果表明表达产物rVVC能与抗6×His组氨酸单克隆抗体特异结合。2.2小鼠免疫学指标(1)小鼠脾、胸腺重量检测结果蛋白抗原组小鼠脾重量较对照组为高(P=0.004),差异具有统计学意义;菌体抗原组小鼠脾重量与对照组比较,P=0.919,无统计学差异。菌体抗原组、蛋白抗原组与对照组小鼠胸腺重量比较差异均无统计学意义。(2)小鼠脾淋巴细胞转化率检测结果菌体抗原组小鼠ConA刺激的T淋巴细胞转化率、LPS刺激的B淋巴细胞转化率较对照组高(P=0.018、P=0.001),差异具有统计学意义,其Vv刺激的淋巴细胞转化率较对照组高,但差异不具有显著性(P=0.216);蛋白抗原组小鼠ConA刺激的T淋巴细胞转化率、LPS刺激的B淋巴细胞转化率及rVVC刺激的淋巴细胞转化率与对照组比较,差异均无显著性。(3)小鼠外周血淋巴细胞亚群检测结果三组小鼠外周血的CD19~+ B淋巴细胞百分比差异具有统计学意义(P=0.03),菌体抗原组、蛋白抗原组均高于对照组。三组小鼠外周血的CD4~+T细胞及CD8~+T细胞之百分比差异无统计学意义,CD4~+/CD8~+比值差异也无统计学意义。(4)血清凝集试验结果第3次免疫后,菌体抗原组与蛋白抗原组小鼠血清与菌体悬液混合,呈现流沙样阳性反应;对照组小鼠血清、生理盐水与菌体悬液混合均为阴性结果。(5)小鼠血清抗体IgG效价测定结果第5次加强免疫后,取小鼠血液行间接ELISA检测血清抗菌体/rVVC蛋白IgG效价,菌体抗原组血清抗菌体效价最高达1:25600,蛋白抗原组血清抗rVVC效价最高达1:25600。以各组血清最高稀释度取对数值1g行两独立样本t-检验,结果表明:菌体抗原组小鼠抗菌体IgG效价高于对照组,差异具有统计学意义;蛋白抗原组小鼠抗rVVC蛋白IgG效价高于对照组,差异具有统计学意义。(6)Western-blot检测结果将纯化复性后的rVVC经SDS-PAGE后,转移到PVDF膜上,以鼠抗rVVC血清为一抗进行Western-blot反应,结果显示rVVC能与免疫血清特异性结合,在相应大小处(约70KD)出现了特异性反应区带。2.3创伤弧菌攻击试验结果(1)小鼠一般情况生理盐水对照组注射菌液后36h内10只小鼠死亡,2只小鼠存活,存活率为16.7%;其中一只小鼠左后肢出现脓肿、破溃及溃疡形成,后肢活动明显受限。菌体抗原组及蛋白抗原组小鼠注射菌液后出现毛发竖立、进食减少、蜷缩少动等情况,但均较对照组为轻,48b内小鼠均存活,存活率为100%。菌体抗原组及蛋白抗原组小鼠48h存活率均高于对照组,差异具有统计学意义。对照组小鼠血培养为阳性,还原鉴定为创伤弧菌。菌体抗原组及蛋白抗原组小鼠注射菌液后48h血培养为阳性,10d培养为阴性。(2)病理改变生理盐水对照组死亡小鼠各脏器组织充血淤血病变严重,局部见中性粒细胞浸润;存活小鼠各组织基本正常,其中一只后肢皮肤溃疡形成、软组织呈蜂窝织炎改变。菌体抗原组及蛋白抗原组48h处死小鼠各脏器组织轻度淤血,可见炎细胞浸润;10d处死小鼠:蛋白抗原组肝组织局部细胞灶状、片状坏死,呈脓肿样改变;其余各组织基本正常。结论1创伤弧菌ATCC27562对紫外线敏感,属紫外线低度抗性菌;90μW/cm~2的紫外线能有效灭杀创伤弧菌ATCC27562,20g/L戊二醛、5g/L过氧乙酸、75%乙醇能将其迅速有效灭活。2创伤弧菌菌体抗原、创伤弧菌溶细胞毒素蛋白抗原能有效刺激、增强BALB/c小鼠特异性体液免疫功能,产生创伤弧菌菌体抗体及创伤弧菌溶细胞毒素蛋白抗体,使小鼠获得有效的免疫保护,可作为创伤弧菌的候选疫苗进一步研究。3致死量创伤弧菌侵犯BALB/c小鼠,小鼠体内创伤弧菌菌体抗体、溶细胞毒素蛋白抗体不能完全将其杀灭,能有效减轻其毒性作用,明显提高小鼠生存率,降低致残作用。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-15
前言  15-21
  参考文献  17-21
第一章创伤弧菌生化鉴定及其消杀抗性研究  21-35
  1 材料与方法  21-25
  2 结果  25-31
  3 讨论  31-33
  4 小结  33
  参考文献  33-35
第二章创伤弧菌菌体抗原及溶细胞毒素蛋白抗原主动免疫的动物实验研究  35-76
  第一节创伤弧菌溶细胞毒素的提取、纯化及鉴定  35-50
  第二节创伤弧菌菌体抗原及溶细胞毒素蛋白抗原对BALB/c小鼠的主动免疫实验研究  50-74
  参考文献  74-76
全文小结  76-77
附录  77-78
攻读学位期间发表论文  78-79
致谢  79-81
研究生毕业论文统计学审稿证明  81

创伤弧菌消杀抗性及其菌体抗原、溶细胞毒素蛋白抗原主动免疫的动物实验研究

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