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基于结构解析的醛酮还原酶AKR5C3的底物选择性研究

作　者: 刘旭
导　师: 魏东芝
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 氧化葡萄糖酸杆菌醛酮还原酶氨基酸定点突变晶体结构
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

来源于氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans的一种新型醛酮还原酶Gox0644具有广泛的底物特异性,对2,3-二酮、α-酮醛、α-酮酯、2,5-二酮-D-葡萄糖酸及脂肪醛和芳香醛表现较高的还原活性,特别是选择性还原α-酮羰基化合物所生成的手性的S-羟基酮是多种药物合成的关键前体,而还原2,5-二酮-D-葡萄糖酸所生成的2-酮-L-古龙酸则是维生素C合成的中间体。根据醛酮还原酶家族的系统分类学法则,Gox0644命名为AKR5C3。为了深入了解AKR5C3的底物识别和催化机理,从而实现酶的理性改造以促进其在手性合成工业中的应用,本论文首次报道了AKR5C3的晶体结构,并对其活性中心等结构域及其底物的选择性展开研究。本论文得到了AKR5C3、二元复合物AKR5C3-NADPH及三元复合物AKR5C3-NADPH-Substrate的晶体结构,对比醛酮还原酶家族中已鉴定的蛋白质晶体结构,AKR5C3具有醛酮还原酶典型的(α/β)8桶状结构,但不存在醛酮还原酶家族典型的Loop结构,Loop结构一般与底物的识别和结合密切相关。结合点突变和活性检测实验,确定了保守的四联体Asp53、Tyr58、Lys79和Hisl12组成酶的催化中心,负责底物的催化。Asp53和Lys234与辅酶NADPH的结合密切相关。Trp191和Arg192为酶与底物结合部位的关键氨基酸。本论文通过点突变的设计、蛋白质晶体结构和酶学动力学参数的分析,重点探讨了53位Asp在催化反应中的作用机制,D53A突变形式促进了酶与辅酶的结合,导致结合的NADPH的位置偏移,从而对底物结合口袋产生影响；而且对辅酶亲和力的显著增强也促进了催化反应的效率。本研究还发现,位于底物结合部位的192位的Arg,与底物的识别相关,将其突变为Gly,可促进酶与底物的结合,特别是对疏水性强的醛类物质的识别。在研究关键氨基酸位点与酶功能的关系的同时,本论文所发现的这两种正向突变形式(D53A和R192G)对酶的活性改造提供了重要的理论依据。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第1章文献综述  10-20
  1.1 氧化葡萄糖酸杆菌中酶的研究  10-12
    1.1.1 膜结合脱氢酶的研究  10-11
    1.1.2 胞质中氧化还原酶的研究  11-12
  1.2 醛酮还原酶(AKRs)家族概述  12-16
    1.2.1 醛酮还原酶家族分类  13-14
    1.2.2 醛酮还原酶参与的反应类型  14-15
    1.2.3 醛酮还原酶家族结构上的共性  15-16
  1.3 蛋白质晶体的获得与晶体结构的分析  16-17
    1.3.1 蛋白质分子结晶原理  16-17
    1.3.2 蛋白质分子结晶技术  17
    1.3.3 影响蛋白质结晶的因素  17
  1.4 定点突变技术  17-19
  1.5 本课题的研究意义和内容  19-20
第2章材料与方法  20-30
  2.1 实验材料  20-21
    2.1.1 菌株与质粒  20
    2.1.2 主要试剂  20
    2.1.3 培养基配方  20
    2.1.4 主要仪器及设备  20-21
    2.1.5 实验所用程序及软件  21
  2.2 实验方法  21-30
    2.2.1 野生型蛋白质Gox0644的表达和纯化  21-22
    2.2.2 Gox0644晶体的获得  22
    2.2.3 晶体结构的获得  22
    2.2.4 晶体结构的建立  22
    2.2.5 晶体结构分析  22
    2.2.6 氨基酸序列分析  22
    2.2.7 家族分类  22
    2.2.8 氧化葡萄糖酸杆菌基因组的抽提  22-23
    2.2.9 PCR引物设计  23
    2.2.10 PCR反应体系  23
    2.2.11 常规PCR扩增  23
    2.2.12 质粒抽提  23-24
    2.2.13 大肠杆菌感受态细胞的制备  24
    2.2.14 氨基酸定点突变  24-26
    2.2.15 化学转化大肠杆菌感受态细胞  26
    2.2.16 阳性克隆的筛选及验证  26-27
    2.2.17 重组质粒突变后的诱导表达  27
    2.2.18 粗酶液制备  27
    2.2.19 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测突变蛋白的表达  27-28
    2.2.20 突变蛋白浓度测定  28-29
    2.2.21 突变蛋白活性测试  29-30
第3章结果与讨论  30-57
  3.1 Gox0644在醛酮还原酶超家族中的分类  30-31
  3.2 Gox0644蛋白质晶体结构分析  31-34
    3.2.1 整体结构概述  32
    3.2.2 辅酶结合  32-33
    3.2.3 底物结合  33-34
  3.3 Gox0644与Gox1615的比较  34-39
    3.3.1 氨基酸序列分析  35
    3.3.2 酶学性质差异  35-37
    3.3.3 晶体结构比较  37-39
  3.4 突变位点的设计与定点突变  39-46
    3.4.1 突变基因的获得  40-41
    3.4.2 突变基因的测序验证  41-46
  3.5 突变基因在大肠杆菌BL21中的表达  46-50
    3.5.1 与催化四联体相关的突变体蛋白表达  46-48
    3.5.2 与辅酶或底物结合位点相关突变体的蛋白表达  48-49
    3.5.3 突变体对目的蛋白可溶性表达的影响  49-50
  3.6 突变体的酶活测定分析  50-57
    3.6.1 蛋白浓度测定  50
    3.6.2 与催化四联体相关的突变体酶活分析  50-53
    3.6.3 与辅酶结合位点相关的突变体酶活分析  53
    3.6.4 与底物结合位点相关的突变体酶活分析  53-55
    3.6.5 R192G、D53A突变体的酮还原活性分析  55-57
第4章结论与展望  57-58
  4.1 结论  57
  4.2 展望  57-58
参考文献  58-63
致谢  63

基于结构解析的醛酮还原酶AKR5C3的底物选择性研究

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