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川芎嗪对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的保护作用

作　者: 张瑞宁
导　师: 傅淑霞
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 肾间质纤维化肾小管上皮转分化(EMT) 川芎嗪分化抑制因子1 小窝蛋白1 转化生长因子β1
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的观察单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型分化抑制因子1(Id1)蛋白与肾小管上皮细胞-间充质转分化(EMT)的关系以及川芎嗪对UUO大鼠肾间质纤维化是否有抑制作用,其肾脏保护作用的可能机制。方法60只清洁级雄性SD大鼠,随机分为A组(假手术组)、B组(UUO组)、C组(川芎嗪组)、D组(厄贝沙坦组),每组各15只。在无菌条件下行左侧输尿管结扎术,其中A组开腹后,分离出左侧输尿管,但不结扎,其余步骤相同。术前1日开始, C组给予川芎嗪混悬液40 ml.kg-1.d-1(腹腔注射),D组给予厄贝沙坦50 mg.kg-1.d-1(溶于适量生理盐水中灌胃),A组和B组给予等量生理盐水灌胃,每日一次。在术后分别于第3、7和14天取出左侧肾脏后处死动物。取左肾下极约1/3肾组织,垂直于肾门将肾组织分成3份,1份放入中性甲醛固定液中,1份放入FAA固定液中,余下组织迅速放入液氮灌中,尔后-80℃冰箱保存测荧光实时定量PCR(real-time PCR)。然后行石蜡包埋,分别用于马松染色(MASSON)、苏木素伊红染色(HE)、过碘酸-Schiff(PAS)染色及免疫组织化学染色。病理染色观察4组大鼠肾间质面积改变及肾间质纤维化的程度,炎症细胞浸润与肾小管上皮细胞及管腔形态变化等。免疫组化法检测肾间质中转化生长因子-β1(TGF-β1)、Id1、小窝蛋白1(Cav1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)及I型胶原的分布与表达,并进行病理图象分析,计算阳性面积比率。采用单因素方差分析法分别在各时间点将4组作比较,并在一组内将同一时间点样本两两间进行t检验。并在B组内将免疫组化指标表达量变化进行相关性分析。应用SPSSS统计软件进行统计分析。荧光实时定量PCR检测各组肾组织Id1mRNA的表达。于术后各时间点评估肾间质纤维化程度及肾小管间质损害程度。其中肾小管间质损害程度采用百分比评分法进行评估。结果1肾组织病理及胶原含量的变化:肉眼观察B组术后,结扎侧肾脏肿大,肾盂肾盏扩张,肾实质变薄。光镜示:B组随梗阻时间延长,肾脏逐渐出现肾小管扩张及萎缩,肾间质单核淋巴细胞浸润,由皮髓交界处开始逐渐出现间质纤维化,而肾小球无明显病理变化,与A组小管损伤程度及间质纤维化的程度同时间点相比均有统计学意义(p<0.05﹚。C组和D组可减轻小管损伤程度、间质纤维化程度及减少Ⅰ型胶原含量,与B组各时间点相比均有统计学意义(p<0.05),且治疗组之间差别无统计学意义(p>0.05)。2川芎嗪抑制肾小管上皮细胞-间充质转分化:(1) Id1、Cav1的表达:从术后第3天起, B组Id1蛋白及Id1mRNA的表达已明显增加, Id1mRNA表达于术后3天达峰,为:(0.044±0.0011[0]),且表达减少,至14天时降至(0.019±0.008),而Id1蛋白表达于第7天达高峰,B组各时间点表达有统计学意义(p均<0.05[0]);与B组相比,C组从第7天起抑制Id1蛋白表达,有统计学意义(p<0.05),且持续至第14天;C和D组比较抑制作用无统计学差异(p>0.05)。Id1蛋白的阳性面积与肾组织中Cav1的含量明显正相关,且两者均显著表达于扩张,坏死的近端肾小管上皮细胞。A组Cav1于肾小球囊壁层上皮细胞,B组术后3天近端小管上皮细胞表达明显升高,为:(16.05±4.768vs2.95±0.911)%(p<0.05)。C和D组Cav1的升高趋势被抑制,与B组相比, C组术后第3天即出现统计学意义为(9.74±1.831vs16.05±4.768)(p<0.05)。C、D两组间差别无统计学意义(p<0.05)。(2)细胞类型标记抗体的表达:A组正常肾上皮组织可见Ecadherin显著表达,在肾间质的阳性面积为(40.98±4.801)%,血管平滑肌细胞和间质有极少量成纤维细胞α-SMA表达阳性。UUO术后第3天起,B组Ecadherin的表达即开始下降,肾小管上皮细胞出现α-SMA表达,与A组差异有统计学意义(p<0.05)。与B组相比,C及D组均反相调节上述因子表达;川芎嗪延缓Ecadherin的下调持续至术后14天,时间较厄贝沙坦组长;两种药物抑制α-SMA表达均于术后7天显著,两组间差别无统计学意义,p>0.05。(3)促纤维化因子(TGF-β1)的表达:TGF-β1 A组肾小管偶有着色且不明显,B组术后其表达遍布于皮质与髓质损伤的肾小管,且表达量随小管损伤范围的增加及肾间质纤维化的加重呈明显升高趋势。术后第3天,B组大鼠肾组织TGF-β1表达量较假手术组有明显增加,第14天达高峰。而治疗组大鼠肾组织各时间点TGF-β1表达量较B组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1的阳性面积与肾组织中α-SMA表达明显正相关,术后3、7、14天r分别为0.904、0.929、0.849,p均<0.05。结论1 Id1蛋白与Cav1蛋白结合,调控肾小管上皮细胞间充质转分化。2川芎嗪可通过抑制UUO术后肾组织中促纤维化因子的表达,部分逆转EMT,延缓肾间质纤维化,其疗效与厄贝沙坦相似。

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-13
研究论文川芎嗪对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的保护作用  13-52
  前言  13-14
  材料与方法  14-23
  结果  23-27
  附图  27-38
  附表  38-41
  讨论  41-49
  参考文献  49-52
综述小窝蛋白1 与肾脏疾病  52-63
致谢  63-64
个人简历  64

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