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密码子优化和分子佐剂增强新城疫病毒F基因DNA疫苗免疫效果

作　者: 曾伟伟
导　师: 王云峰
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: NDV DNA疫苗密码子优化 C3d IL-2
分类号: S852.52
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

新城疫是由新城疫病毒引起的禽的一种急性、高度接触性传染病,一直是危害养禽业的主要疫病,是世界公认的两大重要禽病之一。传统全病毒灭活疫苗和弱化疫苗在有效预防和控制新城疫的实践中发挥了重要作用,但也存在干扰常规血清学流行病监测、难于区分疫苗免疫与自然感染免疫反应的缺陷。为此,开展新城疫基因工程疫苗的研究,为新城疫的防制提供新的防疫手段具有重要意义。DNA疫苗的抗原合成和提呈过程与病原的自然感染相似等诸多优点,被认为是最具潜力的基因工程疫苗之一。本研究对新城疫病毒F基因进行了优化,并用IL-2和不同拷贝数的C3d作为分子佐剂,构建了F基因真核表达质粒,对其体外表达水平及体内免疫保护效果进行了评估,以期遴选出免疫剂量小、经济成本低、有商品化潜力的NDV DNA疫苗。首先,对NDV F48E9株的F基因进行优化,将F基因ORF的密码子全部替换为鸡体内偏嗜的密码子,在上游引入Kozak序列,改造后的基因通过人工合成后命名为optiF,插入到真核表达载体pVAX1获得重组质粒pVAX1-optiF。间接免疫荧光和Western-blot检测结果显示,与未经修饰的F基因(pVAX1-F)相比,optiF基因体外瞬时表达水平明显提高;2周龄SPF鸡接种试验(200μg/只剂量,间隔2周加强免疫,二免2周后攻毒)表明,F基因密码子的优化可显著提高NDV F48E9株DNA疫苗诱导的保护性体液免疫和细胞免疫应答水平,增强免疫保护效果,一免后2周,pVAX1-optiF质粒免疫鸡的特异性抗体水平显著高于pVAX1-F质粒免疫鸡(P<0.05),一免后27天,pVAX1-optiF质粒免疫鸡的CD4+、CD8+及TCRγδT淋巴细胞百分含量和淋巴细胞增殖反应OD570值均显著高于pVAX1-F质粒免疫鸡(P<0.01),所有pVAX1-optiF免疫鸡均获得完全保护,其保护率(12/12)显著高于pVAX1-F免疫组(2/12)。其次,构建含有密码子优化的NDV F48E9株F基因(optiF)的表达质粒pV-optiF、表达鸡源IL-2的真核表达质粒pV-IL-2和融合表达1-6个拷贝C3d(鸡源)与optiF基因的质粒pV-C3dn-optiF(n=1-6),以进一步探讨分子佐剂C3d和IL-2对低剂量NDV F基因DNA疫苗的免疫增强作用。结果表明,融合单拷贝分子佐剂C3d的重组质粒pV-C3d-optiF以及pV-optiF共免疫表达IL-2的质粒所诱导的保护性体液免疫、细胞免疫以及对强毒的攻击保护效果比相应的其他质粒好。其中,以免疫20μg pV-C3d-optiF和200μg pV-optiF共免疫表达IL-2的免疫效果最佳。总之,通过密码子优化和引入分子佐剂(C3d和IL-2)可以显著提高新城疫病毒F基因DNA疫苗的免疫应答水平,使其有效免疫保护剂量降低至20μg水平,具备推广应用的经济可行性。pVAX1-C3d-optiF和pVAX1-optiF+IL-2作为免疫效果良好、成本低廉的优化DNA疫苗,有望成为新城疫的高效、安全新型基因工程疫苗。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章引言  12-31
  1.1 新城疫及新城疫病毒  12-19
    1.1.1 新城疫概述  12-13
    1.1.2 NDV 基本特征  13
    1.1.3 NDV 的生物学活性  13-14
    1.1.4 NDV 的基因组结构  14-15
    1.1.5 NDV 的致病力的分子基础  15
    1.1.6 新城疫疫苗研究进展  15-19
  1.2 提高 DNA 疫苗免疫效果的策略  19-25
    1.2.1 载体优化  20-21
    1.2.2 抗原优化  21-22
    1.2.3 合适的分子佐剂  22-24
    1.2.4 优化接种方法和接种途径  24-25
  1.3 分子佐剂 C3d 在免疫应答中的作用及作用机制  25-27
  1.4 IL-2 作为免疫佐剂的应用  27-29
  1.5 本研究的目的和意义  29-31
第二章密码子优化增强 NDV F 基因 DNA 疫苗的免疫效果  31-45
  2.1 材料  31-32
    2.1.1 质粒载体、细菌、病毒与细胞  31
    2.1.2 主要试剂和仪器  31-32
    2.1.4 SPF 鸡胚和 SPF 鸡  32
  2.2 方法  32-35
    2.2.1 F 基因密码子优化  32
    2.2.2 优化后 F 基因真核表达载体的构建  32
    2.2.3 质粒 DNA 的制备  32-33
    2.2.4 重组质粒的体外表达鉴定  33-34
    2.2.5 免疫鸡血清特异性 IgG 抗体测定（ELISA）  34
    2.2.6 免疫鸡外周血 T 淋巴细胞亚类的检测  34
    2.2.7 免疫鸡淋巴细胞增殖试验  34-35
    2.2.8 攻毒后 SPF 鸡主要脏器病理学观察  35
    2.2.9 数据处理  35
  2.3 结果  35-43
    2.3.1 人工合成密码子优化的 F 基因  35
    2.3.2 载体的构建和鉴定  35-36
    2.3.3 pVAX1-F 和pVAX1-optiF 的体外表达  36-37
    2.3.4 免疫及强毒攻击前后的 IgG 抗体变化  37-38
    2.3.5 免疫鸡脾淋巴细胞增殖反应  38-39
    2.3.6 免疫鸡外周血 CD4+、CD8+和 TCR γδ T 细胞数量的动态变化  39-40
    2.3.7 主要脏器的病理学观察  40-42
    2.3.8 试验鸡对 NDV F_(48)E_9株攻击的保护作用  42-43
  2.4 讨论  43-45
第三章 C3d 和 IL-2 增强密码子优化 NDV F 基因 DNA 疫苗免疫效果  45-63
  3.1 材料  45-46
    3.1.1 质粒载体、细菌、病毒与细胞  45
    3.1.2 主要试剂和仪器  45-46
  3.2 方法  46-51
    3.2.1 RT-PCR 扩增鸡补体 C3d 基因  46
    3.2.2 融合表达optiF 与 C3d 真核表达载体的构建  46-47
    3.2.3 质粒 DNA 的大量制备与纯化  47-49
    3.2.4 重组质粒的体外表达鉴定  49
    3.2.5 SPF 鸡的免疫  49-50
    3.2.6 免疫鸡血清特异性 IgG 抗体测定（ELISA）  50
    3.2.7 免疫鸡外周血 T 淋巴细胞亚类的检测  50
    3.2.8 免疫鸡淋巴细胞增殖试验  50-51
    3.2.9 数据处理  51
  3.3 结果  51-59
    3.3.1 鸡补体 C3d 片段的扩增  51
    3.3.2 载体的构建和鉴定  51-52
    3.3.3 重组质粒的体外表达  52-54
    3.3.4 免疫及强毒攻击前后血清特异性抗体的变化  54-55
    3.3.5 免疫鸡脾 T 淋巴细胞增殖反应  55-56
    3.3.6 免疫鸡外周血 CD4+、CD8+和 TCR γδ T 细胞数量的动态变化  56-58
    3.3.7 试验鸡对 NDV F48E9 株攻击的保护作用  58-59
  3.4 讨论  59-63
第四章全文结论  63-64
参考文献  64-77
附录  77-80
致谢  80-81
作者简历  81

密码子优化和分子佐剂增强新城疫病毒F基因DNA疫苗免疫效果

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