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通城猪33天和65天胚胎骨骼肌的LongSAGE分析及3个基因全长cDNA的分离、定位和组织表达谱研究

作　者: 李小平
导　师: 余梅；李奎
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: LongSAGE 通城猪胚胎骨骼肌转录谱比较转录谱基因分离基因定位
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

猪是为人类提供动物蛋白的最主要畜种之一，提高瘦肉生长速度一直是养猪产业追求的重要目标。但随着养猪生产水平的提高和人们消费观念的改变，肉质性状的改善逐渐成为现代育种工作的研究热点。通城猪是农业部2000年确定的第一批19个国家级猪资源保护品种之一，具有肌内脂肪含量高，耐粗放管理，肉质鲜美等特性。有研究表明，猪瘦肉率和肉质性状的表现均与骨骼肌的含量和组织结构特点密切相关。猪瘦肉产量和质量在遗传因素上主要取决于胚胎发育期肌纤维数量的增生和生后期肌纤维体积的膨大，因此研究胚胎期骨骼肌的生长发育具有重要意义。猪骨骼肌的生长发育过程十分复杂，涉及大批基因的作用以及基因间的网络式调控。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展和猪基因组学、功能基因组学的深入研究，在全基因组水平上对影响猪骨骼肌生长发育的基因进行挖掘和利用已成为可能。本论文利用LongSAGE(Long Serial Analysis of Gene Expression，长标签基因表达系列分析)技术构建了来源于通城猪胚胎期33天和65天肌肉组织的LongSAGE标签文库，进行了组织转录谱和比较转录谱分析，并对部分差异表达基因进行进一步的研究，取得了如下结果：1．利用LongSAGE方法构建了通城猪33天和65天的胚胎骨骼肌LongSAGE文库(如下分别用T33和T65简示)，分别获得了50，450和53，927个LongSAGE标签，一共代表了44，558个特异性标签。对两个时期的标签丰度进行分析，发现它们的分布状态相似：80％的标签是单拷贝的，拷贝数目在100以上的标签仅占0.1％。基因鉴定的结果显示，70％左右的标签是非匹配标签(大多数是低丰度表达基因)；匹配标签中，单匹配标签占64％左右，其它是多重匹配标签。2．T33和T65的转录谱分析结果显示，在这两个时期中表达的基因主要参与蛋白质合成、信号转导、转录调控、细胞增殖、代谢和免疫反应等，同时发现一批转录因子，但表达水平较低。3．T33和T65的比较转录谱分析结果显示，两者具有类似的转录谱，但是T33中参与脂质和脂肪酸代谢以及细胞粘附的基因数目多于T65，参与转录及转录调控的基因数目少于T65。4．对两个时期基因的表达情况进行分析，发现506个标签上调表达，其中已知基因有71个，EST和未知标签有170个；352个标签下调表达，其中已知基因有55个，EST和未知标签有118个：只在T33或T65中特异表达的标签数目分别为117和167个。大部分基因上调表达的倍数差异大于下调表达的倍数差异。大部分的骨骼肌结构基因(如TNN12和TNNT2)、胶原蛋白、细胞色素c氧化酶、NADH脱氢酶、ATP合成酶在T65上调表达，且倍数差异大于2，核糖体转录因子呈现出不规律的表达模式。发现大量差异表达极显著的基因，如CKM(Muscle creatine kinase)、VPS33B(vacuolar protein sorting 33B(yeast homolog))和SLN(Sarcolipin)上调表达的倍数差异分别达到24、13.7和16.7倍。5．利用RT-PCR方法获得了上调表达基因BIN1、TNNI2和TNNT2的部分cDNA序列，发现前两个基因具有选择性剪切转录本。组织表达谱分析结果显示这三个基因在骨骼肌组织中的表达量显著高于其它组织。6．用猪×仓鼠辐射杂种板将BIN1基因定位在猪15号染色体上，与微卫星SW1118紧密连锁，LOD值为7.14：TNNT2基因定位在猪10号染色体上，与微卫星SWC19紧密连锁，LOD值为5.45。本研究的结果可为猪胚胎期骨骼肌的研究增添新的资料，有利于加深人们对中国地方品种猪骨骼肌发育的了解，可能为分子育种技术在猪遗传改良中的进一步应用提供新的参考依据。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
1 文献综述  10-21
  1.1 猪基因组研究现状  10-11
  1.2 利用LongSAGE技术进行转录谱(Transcriptome)分析  11-16
    1.2.1 SAGE技术的发展  11-12
    1.2.2 SAGE技术的一般原理和实验过程  12-13
      1.2.2.1 SAGE的原理  12
      1.2.2.2 SAGE的一般实验过程  12-13
    1.2.3 转录谱的研究方法  13-15
    1.2.4 LongSAGE技术是研究转录谱与识别新基因的有效方法  15-16
  1.3 猪骨骼肌发生和发育的研究现状  16-19
    1.3.1 骨骼肌发生和发育的一般过程  16
    1.3.2 骨骼肌发生和发育的分子调控机制  16-17
    1.3.3 关于猪肌纤维的研究  17-18
    1.3.4 猪胚胎骨骼肌的研究现状  18-19
  1.4 猪33天和65天胚胎骨骼肌转录谱研究的必要性  19
  1.5 3个猪差异表达基因BIN1,TNNT2和TNNI2的研究现状  19-21
    1.5.1 BIN1(Bridging integrator 1)基因  19-20
    1.5.2 TNNT2(Troponin T2)基因和TNNI2(Troponin I2)基因  20-21
2 研究目的和意义  21-22
  2.1 目的  21
  2.2 意义  21-22
3 材料和方法  22-33
  3.1 材料  22-24
    3.1.1 构建LongSAGE标签库所需材料和试剂  22
    3.1.2 三个差异表达基因的研究材料  22
      3.1.2.1 组织样品  22
      3.1.2.2 DNA样品  22
    3.1.3 主要试剂及配制  22-24
      3.1.3.1 主要试剂  22-23
      3.1.3.2 主要试剂的配制  23-24
      3.1.3.3 菌株  24
    3.1.4 主要仪器及分子生物学软件  24
  3.2 方法  24-33
    3.2.1 胚胎骨骼肌样品的采集  24
    3.2.2 总RNA的提取及完整性检测  24-25
    3.2.3 RNA的反转录  25
    3.2.4 LongSAGE标签库的构建  25-26
    3.2.5 LongSAGE标签库的分析  26-27
      3.2.5.1 LongSAGE标签的鉴定  26
      3.2.5.2 T33和T65的转录谱分析  26-27
      3.2.5.3 T33和T65高表达标签的GO(Gene Ontology)分析  27
      3.2.5.4 差异表达标签的统计分析  27
    3.2.6 三个差异表达基因全长cDNA的分离  27-29
      3.2.6.1 组织样品RNA的制备和反转录  27
      3.2.6.2 引物设计  27-28
      3.2.6.3 PCR扩增条件  28
      3.2.6.4 PCR产物的纯化、克隆和测序  28-29
    3.2.7 三个差异表达基因的组织表达谱分析  29-30
    3.2.8 两个差异表达基因的RH物理定位法  30-32
      3.2.8.1 引物设计  30
      3.2.8.2 PCR扩增及其分型方法  30-32
    3.2.9 利用EST信息寻找SNP位点  32-33
4 结果  33-48
  4.1 T33和T65 LongSAGE标签库的整体情况  33-34
  4.2 T33和T65转录谱分析结果  34-36
  4.3 T33和T65高表达标签的GO分析结果  36-37
  4.4 在T33和T65中差异表达的标签统计分析结果  37-38
  4.5 三个差异表达基因全长cDNA的分离结果  38-44
    4.5.1 BIN1基因的cDNA序列分析  39-41
    4.5.2 TNNI2基因的cDNA序列分析  41-43
    4.5.3 TNNT2基因的cDNA序列分析  43-44
  4.6 三个差异表达基因组织表达谱分析结果  44-45
  4.7 BIN1和TNNT2基因的RH物理定位结果  45
  4.8 BIN1基因的SNP位点预测结果  45-48
5 讨论  48-53
  5.1 猪胚胎发育时期的选择  48
  5.2 通城猪胚胎骨骼肌33天和65天的转录谱特点  48-49
  5.3 关于利用LongSAGE方法研究猪胚胎骨骼肌转录谱  49-51
  5.4 SAGE／LongSAGE数据库分析方法的探讨  51-52
  5.5 关于高通量方法筛选差异表达基因进行功能研究的思考  52-53
6 小结  53-55
  6.1 本研究获得的主要结果  53
  6.2 本研究的创新点与特色  53-54
  6.3 本研究的不足之处  54-55
参考文献  55-64
附录  64-71
  附录1 缩略词表(Abbreviations)  64-65
  附录2 附表1-3  65-68
  附录3 附图1-4  68-71
致谢  71-72

通城猪33天和65天胚胎骨骼肌的LongSAGE分析及3个基因全长cDNA的分离、定位和组织表达谱研究

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