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盐芥HKT1基因的耐盐功能研究

作　者: 宋开侠
导　师: 张荃
学　校: 山东师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: 盐芥 HKT1 耐盐性钠钾离子均衡基因沉默过量表达
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

Na~+、K~+离子运输与均衡是植物耐盐性的一个关键因素。植物受盐胁迫的一个重要特征即Na~+对植物组织的毒害,其主要表现植物受渗透胁迫及离子胁迫,引发一系列次级胁迫如营养失衡和过氧化胁迫,从而严重干扰植物细胞及植株的水分和离子稳态,使植物细胞中的分子受损、植株生长减缓甚至死亡。而K~+是植物细胞中最丰富的游离态离子,适度的K~+在植物生长和代谢中及抗逆性尤其是抗盐方面担任重要作用。植物的根和地上部均存在大量的转运K~+的载体和通道,它们大多定位在质膜和液泡膜,从而保证植物从土壤中吸收K~+,并利于在不同组织间的分配,使植物在细胞及整体水平上均能维持高的K~+/Na~+比率。其中,植物阳离子载体——HKT家族在Na~+、K~+均衡过程中发挥重要作用。目前认为,植物HKT基因家族参与低钾环境下植物钾离子的吸收,并鉴定其功能为K~+-Na~+共转运载体或Na~+转运载体。很多研究均表明HKT蛋白可提高植物耐盐性。拟南芥AtHKT1是决定植物耐盐的一个关键因子,参与根的Na~+吸收。而盐芥是拟南芥的近亲盐生植物,与拟南芥极为相似,而且同样具有作为遗传模式植物的的形态和生长特性及遗传特点。因此对盐芥ThHKT1的功能、机理等方面研究有助于进一步揭示盐芥耐盐性机制。本研究主要包括以下几方面内容:1.从盐芥中克隆了与Na~+、K~+均衡相关的ThHKT1基因cDNA的全长序列。2.盐芥ThHKT1的过量表达研究其功能1)分别使用35S启动子和拟南芥AtHKT1基因的特异启动子,将全长ThHKT1基因连接到带有Basta除草剂筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301,从而构建了两个ThHKT1基因的表达载体:(1) 35S启动子﹕ThHKT1的过量表达载体;(2) AtHKT1启动子﹕ThHKT1的表达载体。2)将构建好的35S启动子:ThHKT1的过量表达载体和AtHKT1启动子:ThHKT1的表达载体,通过农杆菌分别转化拟南芥sas2-1突变体(拟南芥EMS诱变),实现拟南芥sas2-1即AtHKT1基因的异源互补;0.2% Basta除草剂筛选拟南芥转基因株系;收获种子(T0)后,自交一代得到足量的转基因杂合种子(T1);再次播种获得ThHKT1转基因纯合子T2。3)对所获得的拟南芥转基因转化纯合子植株进行以下分子鉴定和分析:(1)通过Basta基因的PCR扩增,发现所有转基因株系(共18株)均能扩增出大约500bp的Basta基因的特异条带,表明35S启动子:ThHKT1的pCAMBIA3301过量表达载体已整合到拟南芥sas2-1突变体的基因组;(2)不同浓度的KCl(0,50,100 mmol/L)分别处理拟南芥转基因植株、野生型及sas2-1突变体,分别测定其植株地上部分和根的K~+含量,结果表明,转基因植株地上部和根中的K~+含量均高于sas2-1突变体和野生型对照;(3)不同浓度NaCl(0,50,100 mmol/L)分别处理拟南芥转基因植株、野生型及sas2-1突变体,分别测定其植株地上部分和根的Na~+含量,结果表明,转基因植株和sas2-1地上部分和根中的Na~+含量相差不大,转基因植株地上部分Na~+含量高于野生型,根中则较野生型低。3.盐芥ThHKT1的基因沉默研究其功能1)将盐芥ThHKT1部分基因序列(340bp)构建ThHKT1:pCAMBIA3301沉默载体,导入农杆菌并进行盐芥的转化和转基因纯合子的筛选。2)对所获得的盐芥转基因转化纯合子植株进行以下分子鉴定和分析:(1)通过Basta基因的PCR扩增,发现所有转基因株系(共15株)均能扩增出大约500bp的Basta基因的特异条带,表明ThHKT1:pCAMBIA3301沉默载体已整合到盐芥基因组;(2)盐芥转基因株系的RT-PCR初步分析发现,部分转基因株系ThHKT1表达水平与对照相比略有降低;(3)不同浓度的NaCl(0,200,400 mmol/L)分别处理盐芥转基因植株及野生型对照,结果显示转基因植株长势明显弱于对照;分别测定其植株Na~+、K~+含量,结果表明200,400 mmol/LNaCl处理下转基因植株地上部的K~+积累低于对照植株,而其Na~+含量则略高于野生型。由此可见,在正常情况和高钾条件下盐芥HKT1基因过量表达可提高了拟南芥sas2-1突变体植株中的K~+含量;在盐胁迫条件下,盐芥HKT1基因过量表达可减少Na~+转运进入拟南芥sas2-1突变体。研究初步表明盐芥ThHKT1具有K~+转运功能并调控Na~+、K~+离子稳态,进一步的分子鉴定和功能研究仍在进行中。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-10
中英文缩略表  10-11
第一部分文献综述  11-24
  1 植物钠钾离子稳态  11-13
    1.1 植物盐害  11-12
    1.2 Na~+稳态的调节机制  12-13
    1.3 植物中K~+的作用及转运机制  13
  2 HKT 类蛋白的分类及结构  13-15
    2.1 HKT 类蛋白的分类  13-14
    2.2 HKT 类蛋白的结构  14-15
  3 植物 HKT 基因的定位与时空表达  15-17
    3.1 HKT 基因的染色体定位  15-16
    3.2 HKT 家族基因的时空表达  16-17
  4 拟南芥AtHKT1  17-20
    4.1 AtHKT1 与 sas2-1 突变体  17
    4.2 拟南芥AtHKT1 与耐盐性  17-20
      4.2.1 AtHKT1 调控Na~+、K~+离子均衡  18-19
      4.2.2 AtHKT1 调节K~+吸收  19
      4.2.3 AtHKT1 与SOS 途径  19-20
  5 植物HKT  20-21
    5.1 水稻OsHKT  20
    5.2 小麦TaHKT1  20-21
    5.3 冰叶日中花McHKT1  21
  6 植物K~+转运相关的其它基因  21-22
    6.1 拟南芥K~+转运体AtKUP  21-22
    6.2 大麦高亲和 K~+转运体 HvHAK1  22
      6.2.1 NaCl 胁迫上调HvHAK1 表达水平  22
      6.2.2 HvHAK1 与Rb~+的转运  22
  7 盐芥HKT1 耐逆性研究的意义  22-24
第二部分实验论文  24-48
  一、实验材料和方法  24-34
    1 实验材料  24-25
    2 实验方法  25-34
  二、实验结果与分析  34-48
    1 盐芥ThHKT1 cDNA 的分子克隆与鉴定  34-37
      1.1 盐芥总RNA 的提取  34
      1.2 ThHKT1 cDNA 全长的克隆  34
      1.3 盐芥ThHKT1 与其它植物HKT 的氨基酸序列比对分析  34-35
      1.4 HKT1 蛋白结构域分析  35-37
      1.5 MEGA 软件分析 HKT 并建立进化树  37
    2 35S 启动子:ThHKT1 过量表达载体的构建及遗传分析  37-41
      2.1 35S 启动子:ThHKT1 过量表达载体的构建  37-38
      2.2 转基因拟南芥的筛选  38
      2.3 转基因拟南芥植株的分子遗传分析  38-39
        2.3.1 转基因植株的PCR 分子鉴定  38-39
      2.4 转基因拟南芥植株的表型分析  39-41
    3 AtHKT1 启动子:ThHKT1 表达载体的构建及遗传转化  41-42
      3.1 拟南芥AtHKT1 启动子的克隆  41
      3.2 AtHKT1 启动子:ThHKT1 表达载体的构建  41-42
      3.3 转基因植株的遗传转化与筛选  42
    4 ThHKT1:pCAMBIA3301 沉默载体的构建及遗传分析  42-46
      4.1 ThHKT1:pCAMBIA3301 沉默载体的构建  42-43
      4.2 转基因盐芥植株的筛选  43
      4.3 转基因植株的遗传分析  43-44
      4.4 盐芥 ThHKT1 基因沉默植株的表型分析  44-46
    5 讨论  46-48
参考文献  48-54
附录  54-56
攻读硕士期间发表文章  56-57
致谢  57

盐芥HKT1基因的耐盐功能研究

内容摘要

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