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滩寒杂交羊PRNP等位基因密码子136、154和171的多态性研究

作　者: 赵春林
导　师: 吴润
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 绵羊 PRNP等位基因 136、154和171位密码子 多态性 PCR-SSCP 条件优化
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


【目的】本研究拟以绵羊PRNP等位基因高变区扩增片段为研究对象进行PCR-SSCP优化试验,以期建立适合于绵羊PRNP等位基因多态性研究的PCR-SSCP分析方法;用PCR-SSCP技术分析甘肃省永昌羊场104只健康滩寒杂交绵羊(滩羊×小尾寒羊)(♀)PRNP等位基因多态性,以了解和掌握此绵羊群体PRNP 136、154和171位密码子等位基因型频率分布,并依此评估其罹患绵羊痒病的可能性。同时,筛选出用于抗痒病育种的ARR纯合子或ARR杂合子等位基因型绵羊个体,为下一步抗痒病育种计划提供基础种羊。【方法】试剂盒法提取绵羊全血基因组DNA,设计特异性引物扩增绵羊PRNP等位基因目的片段。(1)以此扩增产物为试验材料,就交联度、凝胶浓度、甘油浓度、电泳电压、电泳时间、上样量、PCR产物与变性缓冲液比例、电泳缓冲液离子浓度等影响SSCP分析的因素进行优化,建立绵羊PRNP等位基因目的片段PCR-SSCP分析法。(2)进行各扩增产物的琼脂糖凝胶电泳、纯化回收目的片段、连接pMD-18T载体、转化E.coli DH5α,于LB平板(Amp+)上培养后,挑取无色透明菌落,以PCR扩增、双酶切、SSCP法鉴定并筛选出阳性克隆后测序。应用DNA Star软件比对分析测序结果并确定各绵羊PRNP 136、154和171位密码子等位基因型,经数学统计分析不同等位基因型的频率分布,并对此绵羊群体痒病易感性做出评估。【结果】PCR-SSCP优化试验表明,PCR产物与变性缓冲液比例为1﹕4、电泳缓冲液为0.5×TBE、上样量≥2.0μL且<4.0μL、交联度49﹕1、凝胶浓度12%、甘油浓度0%、电泳电压200V、4℃条件下电泳45h为最佳条件优化组合。从104只绵羊中共检出15个PRNP 136、154和171位密码子等位基因型,其中:痒病易感基因型(ARQ/ARQ,n=38;ARQ/ARH,n=11;VRQ/ARQ,n=5;ARH/ARH,n=2)占53.85%(56/104),半抗性基因型(ARR/ARQ,n=12;ARR/ARH,n=1)计12.50%(13/104),抗性基因型(ARR/ARR)为22.12%(23/104),未知与痒病关系的其他基因型(ARK/ARQ,n=4;ARK/ARH,n=2;AHR/ARQ,n=1;TRQ/TRQ,n=1;TRQ/ARR,n=1;TRQ/ARQ,n=1;ARQ/ARP,n=1;ARK/ARK,n=1)共计11.54%(12/104),其中ARQ/ARP为首次发现。另发现18个其他突变位点,其中L141F、R167G、N176Y和Q189L为已发现突变位点,Y131N、L133P、G134R、E149V、M157T、Y158H、N162P、Y166D、F178S/L、C182S、E199V/M/L、N200I、F201S、M209T为新发现的14个突变位点,数目最多的为E189L(33/208)、R167G(9/208)、L141F(8/208),其余突变频率很低(约0.48～1.92%)。【结论】本研究所建立的绵羊PRNP等位基因多态性PCR-SSCP分析法,经分析应用证明是稳定可靠的。在104只健康滩寒杂交绵羊中,PRNP密码子136、154和171的痒病易感基因型ARQ/ARQ、ARQ/ARH、VRQ/ARQ和ARH/ARH占优势(53.85%,56/104),该绵羊群属于痒病易感/易发群体,一旦痒病传入具有罹患痒病的极大可能性。

全文目录


摘要  2-3
Summary  3-7
缩写词英汉对照表  7-8
第一章 绪论  8-16
  1 绵羊PRNP 等位基因多态性及其与痒病相关性研究现状  8-14
    1.1 绵羊PRNP 等位基因136、154 和171 位密码子的多态性  9-10
    1.2 绵羊PRNP 等位基因多态性与痒病发生的关系  10-12
      1.2.1 绵羊PRNP 等位基因136、154 和171 密码子多态性与痒病发生的关系  10-11
      1.2.2 绵羊PRNP ORF 内其他密码子的多态性及其与抗痒病发生的关系  11-12
    1.3 绵羊PRNP 等位基因多态性与绵羊生产性能的关系  12
    1.4 绵羊痒病与其他基因的相关性研究  12
    1.5 基因多态性研究的常用技术与方法  12-14
    1.6 存在的问题及展望  14
  2 研究的目的和意义  14-15
  3 研究的内容和方法  15-16
第二章 绵羊PRNP 等位基因PCR-SSCP分析条件的优化  16-24
  1 材料与方法  16-19
    1.1 材料  16-17
      1.1.1 绵羊血样  16-17
      1.1.2 主要试剂  17
      1.1.3 主要仪器  17
    1.2 方法  17-19
      1.2.1 绵羊基因组DNA 提取  17
      1.2.2 引物的设计与合成  17
      1.2.3 PRNP 等位基因DNA 片段的PCR 扩增和电泳  17
      1.2.4 SSCP 分析条件优化试验  17-19
  2 结果与分析  19-22
    2.1 绵羊基因组DNA 提取物检测  19
    2.2 PRNP 等位基因DNA 片段PCR 扩增产物的电泳  19-20
    2.3 SSCP 分析条件优化  20-22
      2.3.1 第一轮优化  20-21
      2.3.2 第二轮优化  21
      2.3.3 SSCP 分析最佳条件优化  21-22
  3 讨论  22-24
第三章 滩寒杂交绵羊PRNP 密码子136、154和171 多态性的研究  24-34
  1 材料与方法  24-27
    1.1 材料  24-25
      1.1.1 血样  24
      1.1.2 菌株及质粒载体  24-25
      1.1.3 工具酶及其它相关试剂  25
      1.1.4 主要仪器  25
    1.2 方法  25-27
      1.2.1 绵羊基因组DNA 提取  25
      1.2.2 引物的设计与合成  25
      1.2.3 目的DNA 片段的PCR 扩增  25
      1.2.4 绵羊PRNP 等位基因纯合子、杂合子的SSCP 分析  25
      1.2.5 绵羊PRNP 等位基因的克隆及其筛选与鉴定  25-27
  2 结果与分析  27-30
    2.1 绵羊PRNP 等位基因纯合子、杂合子的SSCP 分析  27
    2.2 绵羊PRNP 等位基因克隆的鉴定  27-30
      2.2.1 PCR 扩增鉴定  27-28
      2.2.2 限制性酶切分析  28
      2.2.3 SSCP 分析鉴定  28
      2.2.4 阳性克隆测序结果比对与变异位点分析  28-30
  3 讨论  30-34
结论  34-35
致谢  35-36
参考文献  36-42
作者简介  42-43
导师简介  43-44

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 羊
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