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昆明白小鼠胚胎干细胞系及转基因小鼠模型的建立

作　者: 李恩书
导　师: 钱其军
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 昆明白小鼠 胚胎干细胞 内细胞团 3i 无血清无饲养层 红色荧光
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)是一种从哺乳动物囊胚的内细胞团(inner cell mass,ICM)或者原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)中分离出来的一群具有全能性分化潜能的未分化细胞。自从小鼠胚胎干细胞系成功建立以来,胚胎干细胞凭借着其独特的全能性以及无限增殖能力受到了众多研究者的青睐。人们对它寄予厚望,越来越多的研究领域希望通过胚胎干细胞来攻克以前难以攻克的难题。本实验的目的是希望通过对昆明白小鼠囊胚的培养,从其自然孵化的内细胞团(ICM)中分离培养胚胎干细胞,摸索昆白品系胚胎干细胞的培养条件,建立昆明白小鼠胚胎干细胞系。并且利用建立的胚胎干细胞系作为介导,用胚胎干细胞法建立昆明种荧光蛋白转基因小鼠模型。ES细胞的无血清无滋养层培养是一项难度较大的工作,且现有的ES细胞系大多是用国外品系的近交系小鼠建立的。昆明白小鼠作为我国应用最多的远交系实验小鼠,其繁殖能力强及遗传差异大的特点使得其有着广泛的应用前景,并且其低廉的价格使得实验的成本大大降低,更适合于节约实验成本。建立昆明白小鼠ES细胞系以及该品系的转基因小鼠有利于以其为实验材料的各项实验的顺利高效进行,并且可以大大降低大规模实验的成本。而无血清无滋养层培养更是可以避免动物源性,简化实验操作步骤,提高实验的效率。本实验经过对昆明白小鼠囊胚ICM的培养,成功的获得并培养了三株昆明白小鼠胚胎干细胞,并且对其进行了多方面的鉴定,主要结论如下:(1)用3i培养液成功培养囊胚,并由囊胚自然孵化获得胚胎干细胞。(2)用2×3i培养液成功培养了获得的昆明白小鼠胚胎干细胞,传代数在40代以上。(3)对获得的昆明白小鼠胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色,结果呈阳性。(4)对获得的昆明白小鼠胚胎干细胞进行免疫荧光检测,结果呈阳性。(5)对获得的昆明白小鼠胚胎干细胞进行Western blot检测Oct4及Sox2,结果均有表达。(6)对获得的昆明白小鼠胚胎干细胞进行Real-Time qRT-PCR检测Oct4、Sox2、Klf4,结果表达量与mESC接近,与MEF有显著差别。(7)对获得的昆明白小鼠胚胎干细胞进行畸胎瘤成瘤实验,6周左右成瘤,成瘤率在85%左右。(8)用pLV300-H794病毒感染获得的昆明白小鼠胚胎干细胞,获得带有红色荧光的昆明白小鼠胚胎干细胞。本实验利用最新的3i培养系统,成功获得并培养了昆明白小鼠胚胎干细胞,并对其进行了多方面的鉴定,结果均显示获得的细胞株为小鼠胚胎干细胞株。利用慢病毒介导转入红色荧光蛋白,获得带有红色荧光的昆明白小鼠胚胎干细胞,为进一步进行嵌合鼠实验及转基因模型的最终建立打下了基础。此外,昆明白小鼠胚胎干细胞无血清无饲养层的成功获得、培养为3i培养系统理论的正确性、真实性提供了一个新的例证。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-15
缩略词表  15-16
第一章 前言  16-26
  1.1 胚胎干细胞概述  16-18
    1.1.1 胚胎干细胞的定义及特点  16
    1.1.2 胚胎干细胞特异性的转录因子  16-18
  1.2 昆明白小鼠概述  18-20
    1.2.1 近交系及远交系小鼠  18-19
    1.2.2 昆明白小鼠  19-20
  1.3 小鼠胚胎干细胞培养体系  20-23
    1.3.1 小鼠胚胎干细胞的分离方法  20
    1.3.2 传统的小鼠胚胎干细胞培养体系  20-22
    1.3.3 胚胎干细胞自我维持的基态  22-23
  1.4 荧光蛋白  23-25
  1.5 研究目的及意义  25-26
第二章 昆明白小鼠囊胚的获得及培养  26-33
  2.1 材料与主要试剂及设备  26-28
    2.1.1 材料  26
    2.1.2 试剂  26
    2.1.3 仪器设备  26-27
    2.1.4 主要试剂配制  27-28
  2.2 方法  28-30
    2.2.1 昆明白小鼠超数排卵及囊胚的获得  28-30
    2.2.2 昆明白小鼠囊胚的培养  30
  2.3 结果  30-32
    2.3.1 昆明白小鼠胚胎干细胞囊胚  30-31
    2.3.2 昆明白小鼠囊胚孵化及培养  31-32
  2.4 讨论  32-33
第三章 昆明白小鼠胚胎干细胞的获得及培养  33-40
  3.1 主要试剂及设备  33-34
    3.1.1 试剂  33
    3.1.2 仪器设备  33-34
    3.1.3 主要试剂配制  34
  3.2 方法  34-37
    3.2.1 昆明白小鼠胚胎干细胞获得  34-35
    3.2.2 昆明白小鼠滋养层的制备  35
    3.2.3 昆明白小鼠胚胎干细胞的培养  35-37
  3.3 结果  37
  3.4 讨论  37-40
第四章 昆明白小鼠胚胎干细胞鉴定  40-49
  4.1 主要材料、试剂及设备  40-41
    4.1.1 材料及细胞株  40
    4.1.2 试剂  40
    4.1.3 仪器设备  40
    4.1.4 试剂配制  40-41
  4.2 方法  41-44
    4.2.1 碱性磷酸酶（AKP）染色  41
    4.2.2 免疫荧光检测  41-42
    4.2.3 Western blot  42
    4.2.4 Real-Time qPCR 检测  42-44
    4.2.5 畸胎瘤实验  44
    4.2.6 嵌合鼠实验  44
  4.3 结果  44-48
    4.3.1 碱性磷酸酶（AKP）染色  44
    4.3.2 免疫荧光检测  44-45
    4.3.3 Western blot  45-46
    4.3.4 Real-Time qPCR 检测  46-47
    4.3.5 畸胎瘤实验  47-48
    4.3.6 嵌合鼠实验  48
  4.4 讨论  48-49
第五章 昆明白转荧光蛋白小鼠模型  49-54
  5.1 材料与主要试剂和设备  49-50
    5.1.1 试剂和药品  49
    5.1.2 质粒和细胞株  49
    5.1.3 仪器设备  49-50
  5.2 方法  50-51
    5.2.1 慢病毒的包装  50-51
    5.2.2 慢病毒的浓缩  51
    5.2.3 慢病毒转染KESC-A 细胞  51
  5.3 结果  51-53
    5.3.1 包装病毒  51-52
    5.3.2 转染KESC-A 细胞  52-53
  5.4 讨论  53-54
第六章 结论  54-55
参考文献  55-62
在学期间发表论文  62-63
致谢  63

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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