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PTD-GFP、PTD-EDAG融合蛋白质的表达、纯化和初步应用

作　者: 张美芳
导　师: 杨晓明
学　校: 天津大学
专　业: 制药工程
关键词: PTD GFP EDAG
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

EDAG是一种与造血细胞分化调控密切相关的核蛋白质,对造血系统发育分化起重要调控作用,但对其作用机制尚缺乏深入的了解。因此,将EDAG蛋白质转导入造血干细胞内,研究其对造血干细胞增殖、分化、凋亡调控的影响,将对阐明其作用机制及应用前景具有重要意义。为将EDAG蛋白质有效导入造血干细胞,我们采用了基于蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD)的蛋白质跨膜递送技术。它能将与之融合的蛋白质以一种浓度依赖的方式跨膜导入细胞,转导效率高,每个细胞内的蛋白质浓度近乎相同,且对细胞损伤较小。目前,其在医学研究领域中的应用已受到广泛的关注。为优化跨膜递送技术各环节的条件,我们选择绿色荧光蛋白质(GFP)为研究对象,系统摸索了表达、纯化、转导等条件。我们首先采用DNA重组技术构建了PTD-GFP表达载体,共构建VP22-GFP、Tat-GFP、Tat-GFP-Tat、Tat-GFP-9R 4种融合蛋白质原核表达载体,转染大肠杆菌BL21,经过摸索诱导剂浓度、菌密度、诱导时间等条件,得到各融合蛋白质的最佳诱导表达条件。在采用Ni-NTA亲和纯化柱纯化融合蛋白质时,我们尝试了两种纯化途径:一是天然蛋白质直接上柱纯化(Native条件)、二是先对表达蛋白质变性,然后纯化并复性(Hybrid条件)。比较两种纯化路线所得蛋白质的跨膜转导能力发现,Hybrid途径纯化的融合蛋白质具有较强的跨膜转导能力,其中Tat-GFP-Tat蛋白质具有最强的活性。随后,我们分别构建了VP22-EDAG、Tat-EDAG、Tat-EDAG-Tat和Tat-EDAG-9R的原核表达载体,转染大肠杆菌BL21,经诱导均可表达目的蛋白质,除由于VP22-EDAG表达量很低,未获得纯化蛋白质外,其余得到相应的蛋白质,并得到Western-bolt的验证。本研究系统摸索了PTD融合蛋白质表达、纯化、转导等条件,并构建了多种PTD-EDAG表达载体,经初步纯化获得Tat-EDAG-Tat融合蛋白质,为进一步研究奠定了基础。

全文目录

中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
前言  8-9
第一章文献综述蛋白质转导结构域的研究进展  9-18
  1.1 蛋白质转导机构域简介  9-10
  1.2 PTD 转导机制的研究现状  10-12
  1.3 PTD 在研究领域的应用  12-14
    1.3.1 PTD 在开发治疗性蛋白质药物方面的应用  12-13
    1.3.2 PTD 在基础科学研究领域的应用  13-14
  1.4 PTD 应用存在的问题  14-15
  1.5 展望  15-18
第二章 PTD-GFP 蛋白质转导模型的建立  18-38
  概述  18-19
  2.1 材料与方法  19-25
    2.1.1 材料  19
    2.1.2 方法  19-25
      2.1.2.1 构建重组质粒  19-21
      2.1.2.2 融合蛋白质的诱导表达条件优化  21-22
      2.1.2.3 融合蛋白质的纯化  22-25
      2.1.2.4 TTG 蛋白质质谱鉴定  25
      2.1.2.5 细胞培养  25
  2.2 结果与讨论  25-35
    2.2.1 VP22-GFP 蛋白质的表达及纯化  25-31
      2.2.1.1 VP22-GFP 质粒载体的构建  25-26
      2.2.1.2 VP22-GFP 融合蛋白质的表达与纯化  26-29
      2.2.1.3 VP22-GFP 蛋白质浓度测定  29-30
      2.3.1.4 VP22-GFP 蛋白质细胞转导能力验证  30-31
    2.2.2 Tat-GFP 蛋白质转导模型的建立  31-35
      2.2.2.1 融合蛋白质的诱导纯化  31-32
      2.2.2.2 TTG 蛋白质质谱鉴定  32-33
      2.2.2.3 融合蛋白质浓度测定  33-34
      2.3.2.4 融合蛋白质细胞转导能力验证  34-35
  2.3 讨论  35-37
  2.4 本章小结  37-38
第三章 PTD-EDAG 融合蛋白质的表达纯化  38-46
  3.1 材料与方法  38-40
    3.1.1 材料  38
    3.1.2 方法  38-40
      3.1.2.1 VP22-EDAG 载体的构建  38-39
      3.1.2.2 VP22-EDAG 蛋白质的表达纯化  39
      3.1.2.3 TTE 蛋白质的表达纯化  39-40
      3.1.2.4 EDAG、TTE 蛋白质的验证  40
  3.2 结果与讨论  40-44
    3.2.1 VP22-EDAG 的表达纯化  40-41
      3.2.1.1 VP22-EDAG 载体的构建  40-41
      3.2.1.2 VP22-EDAG 融合蛋白质的表达与纯化  41
    3.2.2 Tat-EDAGD 融合蛋白质的表达纯化  41-44
      3.2.2.1 TTE 诱导条件的优化  41-42
      3.2.2.2 EDAG 蛋白质的纯化  42
      3.2.2.3 TTE 蛋白质的纯化  42-43
      3.2.3.4 Western-Blot 验证EDAG、TTE 蛋白质  43-44
  3.3 讨论  44-45
  3.4 本章小结  45-46
第四章总结与展望  46-47
  4.1 主要结论  46
  4.2 展望  46-47
参考文献  47-53
致谢  53-54
附录Ⅰ 英文缩略语表  54-55
附录Ⅱ 主要实验仪器  55-56
附录Ⅲ 主要溶液的配置  56-58

PTD-GFP、PTD-EDAG融合蛋白质的表达、纯化和初步应用

内容摘要

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