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重组人Bikunin结构域Ⅰ在毕赤酵母中表达的研究

作　者: 朱洁
导　师: 颜炜群
学　校: 吉林大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 重组 Bikunin domainⅠ 毕赤酵母 表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


尿胰蛋白酶抑制物(Bikunin,urinary trypsin inhibitor,UTI),是由其含有两个Kunitz型家族结构域的结构特征而命名。它是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。Bikunin domainⅠ是Bikunin N端区域的活性结构域,可与细胞表面受体结合。并对组织蛋白酶G和粒细胞弹性蛋白酶有抑制作用。本实验利用基因重组技术,构建人Bikunin domainⅠ重组质粒pMD18-T-hBikunin domianⅠ和重组表达载体pPICZαC-hBikunin domainⅠ,将pPICZαC-hBikunin domainⅠ转化到X-33毕赤酵母中,建立兼具原核系统良好操作性和真核系统后加工性的重组人Bikunin domanⅠ毕赤酵母真核表达体系。通过PCR鉴定和重组人Bikunin domanⅠ活力的测定,筛选出高表达重组人Bikunin domanⅠ的酵母菌株。并进行小规模的发酵和纯化分析。结果表明,本研究正确克隆了人Bikunin domainⅠ序列,构建了重组人Bikunin domainⅠ毕赤酵母真核表达体系,经甲醇诱导可分泌具有胰蛋白酶抑制活性的人Bikunin domanⅠ重组蛋白,相对分子量为6.0 kD,为进一步进行人Bikunin domainⅠ生物学活性功能的研究奠定了基础。

全文目录


内容提要  4-7
英文缩略词表  7-8
第1章 绪论  8-19
  1.1 BIKUNIN 的来源及结构  8-10
    1.1.1 Bikunin 的来源  8
    1.1.2 Bikunin 的基因结构特征  8
    1.1.3 Bikunin 的蛋白质结构特征  8-10
  1.2 BIKUNIN 的生物学功能  10-12
    1.2.1 与炎性介质和细胞因子的作用  10-11
    1.2.2 与肿瘤细胞恶化激活剂的作用  11
    1.2.3 与Ca~(2+)内流、细胞收缩的作用  11-12
    1.2.4 与线粒体，自由基产生的作用  12
  1.3 BIKUNIN 的临床应用  12-14
    1.3.1 Bikunin 在急性胰腺炎的应用  12-13
    1.3.2 Bikunin 在休克治疗中的应用  13
    1.3.3 Bikunin 在体外循环中的应用  13
    1.3.4 Bikunin 在外科手术中的应用  13-14
    1.3.5 Bikunin 在脏器损伤保护的应用  14
  1.4 BIKUNIN DOMAINⅠ的研究进展  14-15
  1.5 重组人BIKUNIN DOMAINⅠ表达系统的挑选  15-17
    1.5.1 原核大肠杆菌表达系统  15
    1.5.2 酵母表达系统  15-17
  1.6 重组人BKUNIN DOMAINⅠ实验设计流程  17-18
  1.7 立题依据  18-19
第2章 重组人BIKUNIN DOMAINⅠ毕赤酵母高效分泌表达体系的建立和鉴定  19-39
  2.1 材料和方法  19-31
    2.1.1 材料  19-21
    2.1.2 方法  21-31
  2.2 结果  31-37
    2.2.1 人Bikunin domainⅠ目的基因的获得  31
    2.2.2 人Bikunin domainⅠ克隆载体的鉴定  31-32
    2.2.3 人Bikunin domainⅠ表达载体的构建鉴定  32-37
  2.3 讨论  37-39
第3章 重组人BIKUNIN DOMAINⅠ的发酵分析  39-50
  3.1 材料和方法  39-43
    3.1.1 材料  39-41
    3.1.2 方法  41-43
  3.2 结果  43-47
    3.2.1 毕赤酵母表达重组人Bikunin domainⅠ的最佳pH 确定  43
    3.2.2 不同pH 条件下诱导毕赤酵母表达重组人Bikunin domainⅠ的活力测定  43-44
    3.2.3 2 L 摇瓶发酵时菌体湿重和上清液OD600 监测结果  44
    3.2.4 2L 摇瓶表达重组人Bikunin domainⅠ最佳时间的确定  44-45
    3.2.5 重组人Bikunin domainⅠ2L 摇瓶表达活力测定  45-46
    3.2.6 重组人Bikunin domainⅠ的纯化分析  46-47
  3.3 讨论  47-50
第4章 研究总结  50-51
参考文献  51-57
致谢  57-58
中文摘要  58-60
ABSTRACT  60-61

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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