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肝素酶CTL表位多抗原肽（MAP）疫苗的设计及其抗肿瘤免疫效应研究

作　者: 王国珍
导　师: 杨仕明
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: 肝素酶多抗原肽 DC细胞 HLA-A2.1限制性 H-2K~b限制性免疫治疗细胞毒T淋巴细胞肿瘤疫苗
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

[背景和目的]肿瘤生物治疗是继手术、放疗及化疗之后的第四种肿瘤治疗方式。而以树突状细胞（Dendritic cells, DCs）为基础的肿瘤免疫治疗是当今肿瘤生物治疗研究的热点。DC是目前发现的具有强大抗原提呈功能的免疫细胞,将肿瘤相关抗原（Tumor-asscociated antigen, TAA）与DC相结合是肿瘤免疫治疗的方式之一。目前所发现的TAA大多具有组织特异性,如AFP抗原只在肝癌中表达,PSA抗原只在前列腺癌中表达,以这些TAA为基础进行肿瘤免疫治疗只能杀伤表达该抗原的肿瘤组织或细胞,其治疗窗窄。因此,寻找可用于大多数肿瘤免疫治疗的肿瘤共有抗原是肿瘤免疫治疗的关键。肝素酶是一种内源性糖苷内切酶,它通过降解基底膜（Basement Membrane,BM）和细胞外基质（Extracellular Matrix ,ECM）中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Heparan Sulfate Proteoglycans,HSPG）促进细胞的迁移。国内外许多研究表明,肝素酶在绝大多数中晚期肿瘤中表达,与肿瘤患者的预后密切相关。抑制肝素酶的表达可以抑制肿瘤的转移,而将肝素酶转染至肝素酶阴性的肿瘤细胞中可以促进肿瘤的转移。我们过去的研究表明,肝素酶全长cDNA负载的DC可以诱导产生肝素酶特异性的细胞毒T淋巴细胞（Cytotic T Lymphocyte,CTL）,对肝素酶阳性且MHC相匹配的胃癌细胞具有明显的杀伤效应,该研究不仅提示肝素酶可作为肿瘤共有抗原用于肿瘤的免疫治疗,而且在肝素酶的全长氨基酸序列中一定存在能诱导产生肝素酶特异性的CTL表位（Epitopes）。为此,我们进一步采用生物信息学及反向免疫学技术,预测并鉴定了3条人肝素酶抗原表位和2条小鼠肝素酶抗原表位。结果表明,上述多肽表位在体内外均可诱导机体产生肝素酶特异性CTL反应,对肝素酶阳性且MHC相匹配的不同来源的各肿瘤细胞具有明显的杀伤效应;动物实验表明,小鼠肝素酶抗原表位对肿瘤荷瘤小鼠具有明显的免疫治疗和免疫保护作用。与肝素酶腺病毒疫苗相比,多肽疫苗可以体外合成,没有病毒载体的参与,安体性明显提高,因此具有更广阔的应用前景。但多肽疫苗由于分子量小,免疫原性弱,易降解,体内可能不能诱导足够强的免疫效应,因此限制了其临床应用。为解决这一弊端,1988年Tam首先提出了多抗原肽（Multiple antigen peptides, MAP）的设计策略,即采用分子量小且免疫原性弱的赖氨酸为核心基质,将若干条（一般为4条或8条）抗原表位单体耦联在一起,形成树枝样结构。这种MAP疫苗的设计原理不仅适用于B细胞表位,而且适用于T细胞表位。基于以上分析,本研究拟在以往研究的基础上,将成功鉴定出的3条人肝素酶CTL表位[277-285（KMLKSFLKA,Hpa277）, 525-533（PAFSYSFFV,Hpa525）和405-413 （WLS LLFKKL, Hpa405）]和2条小鼠肝素酶CTL表位[519-526（FSYGFFVI, mHpa519）和398-405（LSLLFKKL,mHpa398）分别构建成四分枝肽的MAP疫苗,研究其体内及体外的抗肿瘤活性,并与肝素酶CTL表位单体多肽疫苗诱导的CTL活性进行对比,为肝素酶T细胞MAP疫苗抗肿瘤效应的临床应用提供理论依据。[方法]1、将三条人肝素酶CTL表位[ 277-285（KMLKSFLKA, Hpa277） , 525-533 （PAFSYSFFV,Hpa525）和405-413（WLSLLFKKL, Hpa405）]以及两条小鼠肝素酶CTL表位[519-526（FSYGFFVI, mHpa519）和398-405（LSLLFKKL, mHpa398）]设计成MAP结构,采用标准固相肽合成法（SPSS）合成MAPs;采用反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析其纯度;采用液相色谱/质谱联用（LC/MS）测目标多肽分子量。阴性对照肽选用人HLA限制性流感病毒HLA-A2.1限制性表位（NYKHCFEI）。2、按文献分离培养人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DCs。采用光学显微镜观察其形态,并采用流式细胞术鉴定其细胞表面CD分子的表达。然后以人肝素酶MAP肽、相应单肽分别负载DC后,诱导产生肝素酶特异性CTL,制备效应细胞。采用标准51Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对不同靶细胞[SW480结肠癌细胞（Hpa⁺, HLA-A2.1⁺）、KATO-Ⅲ胃癌细胞（Hpa⁺, HLA-A2.1⁺）、U2OS骨肉瘤细胞（Hpa⁺, HLA-A2.1⁺）、MCF-7乳腺癌细胞（Hpa^-, HLA-A2.1⁺）、转染了肝素酶cDNA的MCF-7/Hpa乳腺癌细胞（Hpa⁺, HLA-A2.1⁺）、HepG2肝癌细胞（Hpa⁺, HLA-A2.1-）、转染了HLA-A2.1cDNA的HepG2/HLA-A2.1肝癌细胞（Hpa⁺, HLA-A2.1⁺）]的免疫杀伤效应;采用同样方法检测上述效应细胞对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和DC的免疫杀伤活性以研究其毒副作用;采用ELISPOT技术检测上述效应细胞IFN-γ释放情况。3、按文献分离培养C57BL/6-Tg（HLA-A2.1⁺）小鼠骨髓来源的树突状细胞（mDC）,采用光学显微镜观察其形态,采用流式细胞术鉴定细胞表面CD分子的表达。将所选人肝素酶CTL表位MAP肽、相应单肽负载mDC后,免疫小鼠三次,每周一次。取其脾淋巴细胞作为效应细胞,采用⁵¹Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对上述的靶细胞以及自体淋巴细胞和树突状细胞的杀伤效应;采用ELISPOT检测效应细胞IFN-γ释放。4、按文献方法分离培养获得C57BL/6（H-2K^b）小鼠骨髓来源的成熟树突状细胞（mDC）,光学显微镜观察其形态和流式细胞术检测其细胞表面CD分子的表达。用小鼠肝素酶CTL表位多抗原肽、相应单肽分别负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,然后取其脾淋巴细胞当作效应细胞,采用标准51Cr释放试验检测肝素酶多肽诱导的特异性CTL对不同肿瘤细胞[EL-4淋巴瘤细胞(mHpa⁺,H-2K^b+)、B16黑色素瘤细胞(mHpa⁺,H-2K^b+)、Lewis肺癌细胞(mHpa⁺,H-2K^b+)、P815肥大细胞瘤细胞（mHpa⁺,H-2K^b-）]以及自体淋巴细胞和mDC的免疫杀伤效应。采用ELISPOT检测上述效应细胞IFN-γ释放。5、为研究肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠的免疫保护,先将肝素酶多肽负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,再将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠背部皮下,每10天测一次肿瘤直径,一月后处死,比较肿瘤大小。为研究肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠的免疫治疗作用,先将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,待肿瘤长至1mm左右时,再用肝素酶多肽负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,一月后处死,比较肿瘤大小。为研究肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠的生存时间的影响,采用免疫治疗的研究方法,观察肝素酶疫苗接种后,记录死亡小鼠的死亡时间、数量及组别,观察时间为三个月。6、实验数据以x±SD表示,采用SPSS11.5统计软件进行t检验,当P﹤0.05时认为有统计学意义。[结果]1、采用标准固相肽合成法（SPSS）合成人及小鼠肝素酶MAP肽及相应的单肽。采用反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析其纯度。采用液相色谱/质谱联用（LC/MS）测其分子量。结果表明合成的多抗原肽及相应单肽的纯度均在90%以上,达到国际多肽实验标准。所得肽的分子量理论值与实测值之间无明显差异,说明所合成的肽是我们所需的目的多肽。2、体外（In vitro）和离体（Ex vivo）实验表明,人肝素酶特异性CTL对于肝素酶阳性且HLA-A2.1匹配的SW480、U2OS和KATO-Ⅲ细胞具有明显的杀伤效应,且肝素酶MAP肽诱导的杀伤效应明显高于相应单肽诱导的杀伤效应;但对HLA-A2.1阳性但肝素酶阴性的MCF-7细胞和肝素酶阳性但HLA-A2.1阴性的HepG2细胞均无杀伤效应,而对肝素酶阳性且HLA-A2.1匹配的MCF-7/Hpa细胞和HepG2/HLA-A2.1细胞,且MAP肽诱导的杀伤效应亦明显高于相应单肽诱导的杀伤效应。提示人肝素酶MAP肽能激发较相应单肽更强的特异性抗肿瘤效应;肝素酶MAP肽诱导的CTL反应具有肝素酶特异性且受HLA-A2.1限制。进一步检测了肝素酶特异性CTL对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和DC是否具有免疫杀伤效应,结果表明无论是肝素酶MAP肽诱导的效应细胞,还是相应单肽诱导的效应细胞,均对上述两种靶细胞无明显杀伤效应,提示肝素酶MAP肽疫苗的安全性。ELISPOT检测效应细胞IFN-γ的分泌情况,结果表明MAP肽可以诱导更多的效应细胞产生IFN-γ。在删除CD4⁺T淋巴细胞后,肝素酶MAP肽及相应单肽诱导效应细胞分泌IFN-γ的水平均下降,提示CD4⁺T淋巴细胞在CD8+ T淋巴细胞的生成过程中具有重要作用。3、小鼠肝素酶多肽疫苗的研究表明,小鼠肝素酶特异性CTL对肝素酶阳性且H-2K^b阳性的EL-4淋巴瘤细胞、Lewis肺癌细胞以及B16黑色素瘤细胞具有明显的杀伤效应,且小鼠肝素酶MAP肽诱导的杀伤效应明显高于相应单肽诱导的杀伤效应;而对肝素酶阳性但H-2K^b阴性的P815肥大细胞瘤细胞不具有杀伤效应,对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和mDC亦不具有杀伤效应。进一步采用ELISPOT检测肝素酶特异性效应细胞IFN-γ的分泌能力,结果显示肝素酶MAP肽促进效应细胞IFN-γ的分泌能力明显高于相应的单肽;在删除CD4⁺T淋巴细胞后,上述效应细胞IFN-γ分泌水平均明显下降。4、在体研究小鼠肝素酶MAP肽及其相应的单肽对小鼠的免疫保护及免疫治疗效应。免疫保护效应结果表明小鼠肝素酶MAP肽及其相应的单肽免疫保护组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽组及未保护组（PBS组）（p<0.05）,且MAP肽组小鼠皮下肿瘤体积明显小于相应单肽组（p<0.05）,提示小鼠肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠免疫保护效应高于相应的单肽组。免疫治疗效应结果表明,小鼠肝素酶MAP肽及其相应的单肽免疫治疗组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽组及未治疗组（PBS组）（p<0.05）,且多抗原肽组小鼠皮下肿瘤体积小于相应单肽组（p<0.05）,提示小鼠肝素酶多抗原肽对荷瘤小鼠免疫治疗效应强于相应的单肽组。进一步研究肝素酶多肽疫苗对荷瘤小鼠的生存时间的影响,结果表明,肝素酶MAP肽组荷瘤小鼠生存时间明显长于阴性肽组及未治疗组（PBS组）,同样长于相应的单肽组。[结论]1、采用标准固相肽合成法（SPSS）合成三条人及两条小鼠肝素酶多抗原肽[MAP4-Hpa（525-533）（PAFSYSFFV）,MAP4-Hpa（277-285）（KMLKSFLKA）, MAP4-Hpa（405-413）（WLSLLFKKL）, MAP4-mHpa（398-405）（LSLLFKKL）, MAP4-mHpa （519-526）（FSYGFFVI）]及相应的单肽,采用反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析其纯度,采用液相色谱/质谱联用（LC/MS）测其分子量。结果表明合成的多抗原肽及相应单肽的纯度达到国际多肽实验标准,所合成的肽的分子量理论值与实测值无明显差异,为我们所需的目的多肽。2、无论人还是小鼠的肝素酶MAP肽体外及离体均可诱导产生较相应单肽更强的抗肿瘤反应,这种抗肿瘤免疫效应是肝素酶特异、且受MHC限制。肝素酶特异性CTL,无论是MAP肽诱导的,还是相应单肽诱导的,对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和DCs均无明显的杀伤效应,提示这种疫苗的安全性。此外,肝素酶MAP肽促进效应细胞IFN-γ的分泌能力强于相应的单肽,这种IFN-γ分泌能力在CD4⁺T淋巴细胞删除后明显减少,提示肝素酶MAP可以通过促进IFN-γ的分泌以增强非特异性的抗肿瘤效应,CD4⁺T淋巴细胞在CD8+T淋巴细胞的生成过程中发挥重要作用。3、体内研究证实小鼠肝素酶MAP肽可以增强荷瘤鼠的免疫保护及免疫治疗效应,并且可以明显增加荷瘤鼠的生存率,延长荷瘤鼠的生存时间。以上研究表明,肝素酶MAP肽不仅能激发较相应单肽更强的特异性的抗肿瘤效应,而且还能诱导一个较相应单肽更强的非特异性抗肿瘤的良性循环,这种肝素酶MAP疫苗具有高效、特异、安全的特点,为肝素酶MAP肽疫苗的临床应用提供了理论和实验依据。

肝素酶CTL表位多抗原肽（MAP）疫苗的设计及其抗肿瘤免疫效应研究

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