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纺锤体相关蛋白spindlin1与甲基化组蛋白复合物的结构研究

作　者: 王研
导　师: 郭世华；许瑞明
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: spindlin1蛋白 亚克隆 蛋白质表达纯化 蛋白质晶体 晶体结构
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 24次
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内容摘要


本文利用结构生物学手段对纺锤体相关蛋白spindlin1与其甲基化的组蛋白多肽底物所形成的复合物结构进行了研究。采用原核细胞大量表达的体外重组蛋白,构建了spin基因的原核细胞表达载体pET28a/SUMO和pGEX-2T,根据表达结果,确认了能够得到大量带有his-SUMO标签和GST标签的可溶性重组spindlin1。在LB培养基培养的大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中进行了目的蛋白的大规模表达。电泳检测结果表明,在常规培养和诱导条件下（37℃培养;16℃,0.3mmol/L IPTG诱导表达）,可以得到较为理想的重组目的蛋白。利用柱式层析方法分离纯化了目的蛋白,确立了稳定可重复的纯化策略,即亲和层析→阴离子交换层析→凝胶过滤层析,得到了结晶纯、高浓度（约24mg/mL或0.9mmol/L）的目的蛋白溶液,并用于结晶实验。用纯化的目的蛋白产物进行结晶条件的筛选和优化,最终,确立了稳定可重复且能够形成高质量晶体的结晶条件,即:0.1mol/L CAPS,pH=11;2.0mol/L （NH4）2SO4;0.2mol/L Li2SO4;0.1mol/L Glycine,得到的蛋白质晶体适合于衍射实验。在上海同步辐射光源,利用X射线衍射法分析蛋白质复合物晶体,收集到了一套分辨率达到2.4?的衍射数据,并据此初步解析并修正了spindlin1和它的结合底物H3K4me3多肽复合物的三维结构。通过结构模型得到了关于二者相互作用的详细信息,即:spindlin1的第二个tudor结构域参与识别和结合三甲基化的赖氨酸残基,其中spindlin1上至关重要的氨基酸残基位点是（从N-端开始）Phe116,Trp126,Tyr145,Tyr152等四个带有芳香环的残基;spindlin1上的残基Tyr154和三甲基化的赖氨酸残基之间通过氢键稳定相互作用;spindlin1第二个tudor结构域中的残基Asp159和组蛋白多肽上的残基Arg2之间通过盐键稳定相互作用;组蛋白H3K4me3多肽的残基Arg8或者发生甲基化修饰的残基Arg8可能会伸入到spindlin1第一个tudor结构域中来加强整体的识别和结合力的稳定性。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-11
1 引言  11-20
  1.1 结构生物学概述  11-12
  1.2 表观遗传学概述  12-13
  1.3 植物表观遗传学概述  13-14
    1.3.1 DNA 甲基化  13
    1.3.2 组蛋白共价修饰  13
    1.3.3 RNA 介导的基因沉默  13
    1.3.4 副突变  13-14
    1.3.5 染色质重塑  14
    1.3.6 研究植物表观遗传学的意义  14
  1.4 TUDOR 结构域的研究背景和意义  14-16
  1.5 研究现状  16
  1.6 本课题研究的内容和目标  16-20
    1.6.1 SPIN 基因的亚克隆：原核表达载体的构建、筛选、鉴定  17
    1.6.2 构建成功的SPIN基因原核表达载体的转化和表达  17
    1.6.3 SPINDLIN1 的纯化  17-18
    1.6.4 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物的结晶条件筛选与优化  18
    1.6.5 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物晶体的衍射数据收集与结构解析  18
    1.6.6 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物的结构信息  18
    1.6.7 生物大分子相互作用实验BIA-CORE  18-19
    1.6.8 课题小结  19-20
2 实验材料与方法  20-32
  2.1 实验材料  20-21
    2.1.1 SPIN 基因的表达载体  20
    2.1.2 分别用于载体扩增和基因表达的宿主菌  20
    2.1.3 用于纯化与结晶实验的蛋白质材料  20-21
    2.1.4 用于衍射实验的晶体  21
  2.2 实验试剂与药品  21-22
    2.2.1 SPIN 基因的亚克隆构建  21
    2.2.2 SPINDLIN1 的表达  21
    2.2.3 SPINDLIN1 的纯化  21-22
    2.2.4 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物的结晶实验  22
    2.2.5 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物晶体的衍射实验  22
    2.2.6 BIA-CORE实验  22
  2.3 实验设备与器材  22-24
    2.3.1 SPIN 基因的亚克隆  22
    2.3.2 SPINDLIN1 的表达  22-23
    2.3.3 SPINDLIN1 的纯化  23
    2.3.4 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物的结晶实验  23
    2.3.5 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物晶体的衍射实验  23-24
    2.3.6 BIA-CORE实验  24
  2.4 实验方法  24-32
    2.4.1 SPIN 基因从 PET30A载体构建到PET28A/SUMO 载体的亚克隆  24-26
    2.4.2 SPINDLIN1 在大肠杆菌 BL21(DE3)菌株中的试表达  26-27
    2.4.3 SPINDLIN1 的大规模表达  27
    2.4.4 SPINDLIN1 的纯化  27-29
    2.4.5 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物的结晶实验  29-31
    2.4.6 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物晶体的衍射实验  31
    2.4.7 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物晶体的衍射数据收集  31-32
    2.4.8 结构解析  32
    2.4.9 BIA-CORE实验  32
3 实验结果与分析  32-43
  3.1 SPINDLIN1 的纯化  32-36
    3.1.1 PET28A  32-33
    3.1.2 PGEX-2T-SPIN载体表达的SPINDLIN1 的配体 GST 亲和层析  33
    3.1.3 PET28A/SUMO-SPIN载体表达的SPINDLIN1 的阴离子交换层析  33-34
    3.1.4 PGEX-2T-SPIN载体表达的SPINDLIN1 的阴离子交换层析  34-35
    3.1.5 分离掉纯化标签的SPINDLIN1 的凝胶过滤层析  35
    3.1.6 纯化后得到用于的结晶SPINDLIN1（稀释5 倍）  35-36
  3.2 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物晶体初筛的结晶现象  36-38
    3.2.1 SPINDLIN1 分别与两种底物形成的复合物的结晶现象  36-37
    3.2.2 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物优化后的结晶现象  37-38
  3.3 以H3K4ME3 为底物的复合物晶体的衍射图样  38-39
  3.4 SPINDLIN1-组蛋白多肽复合物晶体结构的解析结果  39-42
    3.4.1 全貌  39
    3.4.2 SPINDLIN1 与组蛋白多肽 H3K4ME3 相互作用的微环境  39-42
  3.5 BIA-CORE 实验结果证明二者作用力非常稳定，特异性非常高  42-43
4 讨论  43-45
  4.1 SPINDLIN1 的性质与功能  43-44
  4.2 复合物晶体的性质  44
  4.3 复合物晶体的衍射  44
  4.4 复合物晶体结构的不完整性  44
  4.5 本课题与植物表观遗传学研究的关系  44-45
5 结论  45-47
  5.1 重组目的蛋白的获得  45
  5.2 目的蛋白的纯化策略  45
  5.3 适于衍射的晶体的获得  45
  5.4 晶体结构的解析  45
  5.5 SPINDLIN1 与组蛋白多肽 H3K4ME3 相互作用的方式  45-46
  5.6 生物大分子的相互作用  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-51
作者简介  51

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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