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Fpr3的原核表达及其单克隆抗体的制备

作　者: 邓妍
导　师: 刘中来
学　校: 华中师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 单克隆抗体 Fpr3 蛋白质结晶 分子伴侣
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


FKBP是生物中广泛存在的一个蛋白质家族。目前在酵母中已经发现了FKBP家族的四个成员：Fpr1, Fpr2, Fpr3, Fpr4。Fpr3是核仁蛋白,可以参与核糖体的装配,指导核糖体或者相关蛋白质穿越核孔复合体。Fpr3还对细胞周期具有调控作用,当细胞周期出现异常情况时,Fpr3就会发挥作用,使细胞周期停滞在G2期。正是由于Fpr3重要的生理功能,我们希望了解其空间结构,但是Fpr3很难结晶。单克隆抗体是一种专门针对一种抗原决定簇的抗体。当单独的蛋白质不能结晶时,往往能与其抗体共同结晶。抗体与相应的蛋白质结合后,可以稳定蛋白质的构象,有利于提高蛋白质结晶的成功率。此时,抗体的作用就相当于分子伴侣。分子伴侣可以与不稳定的蛋白结构结合,通过控制结合和释放来帮助其折叠,组装,转运和降解,而不构成蛋白质结构执行功能时的组份。本实验通过将pEGX-5X-1-fpr3转入大肠杆菌E.coliBL21中,IPTG诱导表达GST-Fpr3融合蛋白,分离纯化蛋白后免疫小鼠,通过细胞融合技术获得了2株可以稳定分泌Fpr3抗体的细胞株,纯化后的单克隆抗体,通过计算得到其分子量为152kDa,这与抗体分子量的理论值相符。对腹水做效价检测和亚类的鉴定,最终得到2株细胞株分泌的抗体的亚类均为IgG1,效价分别为1.5×104,1.0x105。同时还通过Western blot的方法鉴定单克隆抗体的特异性,最终结果证明这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可以特异性的识别Fpr3蛋白。利用抗原和抗体特异性的结合,对我们以后研究Fpr3蛋白的结构和功能起着非常重要的作用。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章 文献综述  10-25
  1.FKBP家族  10-13
    1.1 FKBP生化特征  10
    1.2 研究历史  10-13
    1.3 Fpr3蛋白  13
  2.单克隆抗体  13-16
    2.1 单克隆抗体的定义和制备原理  13-14
    2.2 单克隆抗体的特点  14
    2.3 单克隆抗体的应用  14-15
    2.4 单克隆抗体的研究进展  15-16
  3.分子伴侣  16-19
    3.1 分子伴侣家族  16
    3.2 分子伴侣的作用机制  16-17
    3.3 分子伴侣的功能  17-19
    3.4 分子伴侣发展前景  19
  4.蛋白质结晶  19-23
    4.1 蛋白质结晶的基本过程  20
    4.2 蛋白质结晶的影响因素  20-21
    4.3 蛋白质结晶的常规方法  21-22
    4.4 提高蛋白质结晶成功率的方法  22-23
  5.研究目的与意义  23-25
第二章 材料与方法  25-35
  1.实验材料  25-28
    1.1 菌种和质粒  25
    1.2 主要仪器  25
    1.3 主要试剂  25
    1.4 常用溶液的配制  25-28
  2.实验方法  28-35
    2.1 GST-Fpr3融合蛋白的诱导表达  28-29
    2.2 GST-Fpr3融合蛋白的纯化  29
    2.3 SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白  29
    2.4 蛋白质浓度的测定  29-30
    2.5 Fpr3蛋白的单克隆抗体的制各方法  30-32
    2.6 细胞的冻存与复苏  32-33
    2.7 单克隆抗体的特性鉴定  33-34
    2.8 腹水蛋白量的测定  34
    2.9 稳定性试验  34-35
第三章 结果分析  35-44
  1.GST-FPR3蛋白的表达与纯化  35-36
  2.GST-FPR3蛋白的浓度的测定  36-37
  3.单克隆抗体的制备  37-40
    3.1 抗原最适包被浓度的测定  37
    3.2 细胞融合  37-38
    3.3 杂交瘤细胞的筛选  38-39
    3.4 单克隆抗体的纯化  39-40
  4.单克隆抗体的特性鉴定  40-44
    4.1 单克隆抗体亚类的鉴定及其效价的检测  40-41
    4.2 单克隆抗体对Fpr3蛋白特异性的鉴定  41-43
    4.3 腹水蛋白量的测定  43
    4.4 稳定性试验  43
    4.5 结果总结  43-44
第四章 讨论  44-47
  1.免疫原的选择  44
  2.动物的免疫剂量和免疫时间间隔  44
  3.骨髓瘤细胞的选择  44-45
  4.细胞融合及杂交瘤细胞筛选方法  45
  5.细胞培养中的污染问题和预防办法  45-46
  6.蛋白质结晶  46-47
第五章 总结  47-48
参考文献  48-53
在校期间发表论文  53-54
致谢  54

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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