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阳春砂遗传转化受体系统建立及转基因初步研究

作　者: 刁玲武
导　师: 周联
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中西医结合基础
关键词: 阳春砂愈伤组织正交设计农杆菌转化抗菌肽影响因素
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

砂仁为姜科Zingiberaceae植物阳春砂Amomum villosum Lour.、绿壳砂Amomum villosum Lour.var.xanthioidesT.L.Wu et Senjen或海南砂Amomum longiligulare T.L.Wu的干燥成熟果实,是我国著名的“四大南药”之一,具有1300多年的应用历史。砂仁含有醋酸龙脑酯、樟脑、龙脑β-谷甾醇、香草酸等成分,辛、温,归脾胃经,具化湿开胃、温脾止泻、理气安胎等功效,用于湿浊中阻、脘痞不饥、脾胃虚寒、呕吐泄泻、妊娠恶阻、胎动不安等病症,是临床应用较为广泛的中药材之一,以广东阳春所产的道地阳春砂品质最佳。但近年发现阳春砂品种退化,病虫害严重等问题使砂仁产量、质量受到很大的影响。近年国内外学者已将转基因技术应用于中国传统药用植物的研究中,如将抗菌肽融合基因转入鱼腥草,获得抗菌能力增强的转基因植株。抗菌肽(antibacterial peptide, ABP)又称抗微生物肽(antimicrobial peptide, AMP)或肽抗生素(peptide antibiotics),分布于细菌、病毒和各种动植物体内,具有广泛的抗微生物活性,其生成和释放是机体炎症反应的组成部分,是宿主防御细菌、真菌等病原微生物入侵的重要分子屏障。CN基因是昆虫抗菌肽cecropin B和兔NP-1的融合基因。采用转基因技术将抗病性基因转入阳春砂,以提高其抗菌、抗病能力,是解决病虫害问题的主要途径之一。本论文以未成熟及成熟种子为外植体,采用正交设计法,研究不同植物生长物质对阳春砂愈伤组织诱导的影响,建立并优化阳春砂愈伤组织的遗传转化受体系统；以农杆菌EHA105/pCAMBIA1305.2-CN工程细胞介导抗菌肽CN基因转化阳春砂愈伤组织,设计正交试验,通过分析gus报告基因的瞬时表达情况及目的基因CN的PCR检测,比较转化影响因素,初步建立农杆菌介导的阳春砂愈伤组织的转化条件,为阳春砂的种质资源优化提供条件。1阳春砂愈伤组织遗传转化受体系统的建立以未成熟及成熟种子为外植体,采用正交设计法,研究不同植物生长物质对阳春砂愈伤组织诱导的影响,建立并优化阳春砂愈伤组织的遗传转化受体系统。结果表明：未成熟的种子比成熟种子更适宜作为阳春砂诱导愈伤组织的外植体,最佳阳春砂愈伤组织诱导培养基是：MS+2,4-D (0.5mg·L-1)+6-BA (2mg·L-1)+AgNO3(6mg·L-1)+酸水解酪蛋白(1 mg·L-1),植物生长物质中2,4-D对阳春砂愈伤组织的形成影响最关键,愈伤组织诱导率最高达到65.41%。愈伤组织在分化培养基中易分化生长不定根。5 mg·L-1的潮霉素、500mg·L-1的卡那霉素是筛选阳春砂转基因阳性外植体的最适抗生素浓度。2根癌农杆菌介导CN基因转化阳春愈伤组织的研究以阳春砂愈伤组织为受体材料,以农杆菌EHA105/pCAMBIA1305.2-CN工程细胞介导抗菌肽CN基因转化阳春砂,设计正交试验,通过分析gus报告基因的瞬时表达情况及目的基因CN的PCR检测,比较转化影响因素。结果表明：以gus基因瞬时表达率为转化指标,发现农杆菌浓度、侵染时间、共培养温度、共培养时间及乙酰丁香酮浓度对转化率的影响有显著差异性。筛选出阳春砂愈伤组织遗传转化的最佳条件组合是：农杆菌浓度为OD600=0.5,侵染时间10min,共培养温度24℃,共培养时间4d,共培养培养基添加乙酰丁香酮200μmol·L-1。gus基因瞬时表达呈阳性的愈伤组织经PCR检测可见清晰的目的条带。本论文建立并优化了阳春砂愈伤组织的遗传转化受体系统,并通过农杆菌介导法将外源抗菌肽CN基因转入阳春砂愈伤组织,且优化了转化条件,初步建立阳春砂遗传转化体系。本文为进一步获得转基因阳性植株及阳春砂的基因工程抗病育种研究奠定基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-13
第一部分研究背景及立题依据  13-25
  第一章研究背景  14-24
    1 砂仁的研究概况  14-17
      1.1 砂仁药用价值  14
      1.2 砂仁的品种及分布  14-15
        1.2.1 砂仁品种  14
        1.2.2 正品砂仁资源分布  14-15
      1.3 阳春砂资源与栽培生产现状  15-16
      1.4 砂仁种植存在的问题  16-17
        1.4.1 繁殖方法  16
        1.4.2 授粉  16
        1.4.3 种内变异  16-17
        1.4.4 病虫害  17
      1.5 砂仁的组织培养  17
    2 植物转基因  17-24
      2.1 转基因植物的现状及转基因在药用植物的应用  17-18
      2.2 植物基因转化的受体系统  18-20
        2.2.1 原生质体受体系统  18-19
        2.2.2 愈伤组织受体系统  19
        2.2.3 种质系统  19
        2.2.4 胚状体受体系统  19
        2.2.5 直接分化芽受体系统  19-20
      2.3 根癌农杆菌介导单子叶植物的基因转化  20-24
        2.3.1 根癌农杆菌转化单子叶植物的研究  20
        2.3.2 影响农杆菌转化单子叶植物的因素  20-21
        2.3.3 根癌农杆菌转化单子叶植物的方法  21-22
        2.3.4 单子叶植物转化使用的选择标记及报告基因  22-24
  第二章立题依据和研究内容  24-25
    1 立题依据  24
    2 研究内容  24-25
第二部分实验研究与分析  25-55
  第一章阳春砂愈伤组织遗传转化受体系统的建立  26-43
    1 材料与方法  26-34
      1.1 材料  26-33
        1.1.1 植物材料  26
        1.1.2 实验仪器  26
        1.1.3 实验试剂  26-27
        1.1.4 主要溶液及培养基的配制  27-33
      1.2 方法  33-34
        1.2.1 外植体消毒方法  33
        1.2.2 培养方法与条件  33
        1.2.3 试验设计  33-34
        1.2.4 数据统计及分析方法  34
        1.2.5 愈伤组织的继代与分化  34
        1.2.6 愈伤组织对抗生素的敏感性试验  34
    2 结果与分析  34-41
      2.1 种子成熟程度对愈伤组织诱导的影响  34-36
      2.2 培养基成分对愈伤组织诱导的影响  36-39
      2.3 愈伤组织的分化  39
      2.4 愈伤组织对抗生素的敏感性  39-41
    3 讨论  41-43
  第二章根癌农杆菌介导CN基因转化阳春砂愈伤组织的研究  43-55
    1 材料与方法  43-48
      1.1 材料  43-46
        1.1.1 植物材料  43
        1.1.2 根癌农杆菌菌株及质粒  43
        1.1.3 实验仪器  43-44
        1.1.4 实验试剂  44-45
        1.1.5 主要溶液及培养基的配制  45-46
      1.2 方法  46-48
        1.2.1 农杆菌培养  46-47
        1.2.2 阳春砂愈伤组织的侵染  47
        1.2.3 gus基因瞬时表达的检测  47
        1.2.4 数据统计及分析方法  47
        1.2.5 总DNA提取  47-48
        1.2.6 目的基因的PCR检测  48
    2 结果与分析  48-53
      2.1 gus基因瞬时表达  48
      2.2 正交试验结果  48-50
      2.3 转化影响因素分析  50-52
      2.4 目的基因CN的PCR检测  52-53
    3 讨论  53-55
第三部分总结与展望  55-57
  1 总结  56
    1.1 阳春砂愈伤组织的诱导  56
    1.2 愈伤组织的再分化  56
    1.3 愈伤组织的抗生素筛选浓度  56
    1.4 农杆菌介导抗菌肽CN基因转化阳春砂愈伤组织的影响因素  56
  2 展望  56-57
参考文献  57-61
附录  61-64
  附录1 英文缩写表  61-63
  附录2 研究生在校期间发表论文情况  63-64
致谢  64

阳春砂遗传转化受体系统建立及转基因初步研究

内容摘要

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