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水产品中环丙沙星ELISA快速检测试剂盒的初步研制

作　者: 杨燕燕
导　师: 王寿昆；樊海平
学　校: 福建农林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 环丙沙星完全抗原偶联杂交瘤技术单克隆抗体间接竞争ELISA
分类号: S948
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文分别采用碳二亚胺法和氯甲酸乙丁酯法制备环丙沙星的牛血清白蛋白（BSA）与卵清白蛋白（OVA）载体的人工完全抗原CPFX-BSA和CPFX-OVA。人工完全抗原经SDS-PAGE凝胶电泳初步鉴定后,考马斯亮蓝染色法测定蛋白质分别为1.24 mg/mL和0.58 mg/mL,将偶联抗原稀释至一定浓度,紫外分光光度法测其波形,根据偶联前后波形及吸收峰的变化鉴定偶联物分子量大于载体蛋白,证实CPFX与BSA和OVA偶联成功,根据游离半抗原、载体蛋白和完全抗原偶联物各自的紫外吸光度、摩尔吸光系数初步定量计算出偶联结合比分别为7.2∶1和6.4∶1。质谱法测定CPFX-BSA和CPFX-OVA分子量分别为6.895×10⁴和4.586×104 ,推算偶联比分别为5.6∶1和4.2∶1,进一步证实了偶联比和人工抗原制备成功。制备的完全抗原CPFX-BSA和CPFX-OVA可分别作为人工完全免疫抗原和人工完全包被抗原。以合成的完全抗原CPFX-BSA免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗CPFX-BSA的单克隆抗体,获得1株稳定分泌针对CPFX药物的单克隆抗体细胞株CPFX 5G4,腹水效价达1.28×10^-6 ;SDS-PAGE电泳分析CPFX 5G4蛋白重链和轻链的分子量约为50 KD和25 KD;抗体亚型为IgG3;与部分喹诺酮类药物交叉反应率在8.42%¹7.22%之间,与恩诺沙星的交叉反应率为62.45%,与其他常见药物不发生交叉反应。在CPFX 5G4的基础上优化CPFX检测试剂盒的间接竞争ELISA方法,建立ic-ELISA标准工作曲线,曲线方程为y = ?0.4291x+1.4802,相关指数R² =0.9928,IC₅₀值为192.44 ng/mL,最低检测限为16.29 ng/mL,线性检测范围在15.625¹000 ng/mL之间。分别以鳗鲡血浆、肌肉为基质进行药物添加回收试验,经检测添加回收率在60.02%¹10.05%之间,平均添加回收率分别为88.74%、78.00%,基本满足ELISA免疫法测定兽药残留的要求。

全文目录

中文摘要  8-9
Abstract  9-11
前言  11-23
  第一部分氟喹诺酮类药物概述  11-12
    1 喹诺酮类药物  11-12
    2 氟喹诺酮类药物  12
  第二部分水产品中环丙沙星药物残留  12-19
    1 环丙沙星的结构与物理性质  12-13
    2 环丙沙星药效  13-14
    3 环丙沙星的作用机理  14
    4 环丙沙星药物代谢动力学  14-16
    5 环丙沙星的耐药性问题  16
    6 环丙沙星药物残留问题  16-18
    7 环丙沙星药物残留对于水产行业的影响  18-19
  第三部分环丙沙星残留检测技术研究进展  19-22
    1 微生物检验法（MIA）  19
    2 高效液相色谱法（HPLC）  19-20
    3 液相色谱-串联质谱法（LC-MS）  20-21
    4 毛细管电泳分析法（CE）  21
    5 免疫分析法（IA）  21-22
  第四部分本文的研究意义  22-23
第一章环丙沙星完全抗原的制备与鉴定  23-31
  1 仪器和试剂  23
    1.1 主要仪器  23
    1.2 试剂材料  23
    1.3 工作液配制  23
  2 方法  23-26
    2.1 环丙沙星完全抗原的合成  23-25
    2.2 环丙沙星完全抗原的鉴定  25-26
  3 结果与分析  26-28
    3.1 偶联物的SDS-PAGE 电泳鉴定  26
    3.2 完全抗原蛋白质浓度测定  26-27
    3.3 偶联物的紫外分光光度（UV）法测定  27
    3.4 偶联物的质谱（MASS）鉴定  27-28
  4 讨论  28-31
    4.1 药物半抗原的合成  28-29
    4.2 药物半抗原偶联方法  29
    4.3 EDC 用量的控制  29
    4.4 环丙沙星半抗原与蛋白载体的偶联比  29-30
    4.5 环丙沙星人工抗原的鉴定  30-31
第二章环丙沙星单克隆抗体的制备及性质鉴定  31-55
  1 仪器和材料  31-35
    1.1 主要仪器  31
    1.2 试剂  31-32
    1.3 部分试剂的配制  32-34
    1.4 其他材料  34-35
  2 方法  35-45
    2.1 试验动物免疫  35-37
    2.2 杂交瘤细胞株的建立  37-41
    2.3 单克隆抗体腹水制备  41-42
    2.4 单克隆抗体腹水纯化  42-43
    2.5 单克隆抗体纯度鉴定（SDS-PAGE 电泳法）  43-44
    2.6 单克隆抗体性质鉴定  44-45
  3 结果与分析  45-50
    3.1 Balb/c 免疫小鼠血清中抗体效价的测定iELISA 方法检测  45-46
    3.2 血清抗体特异性的确定  46
    3.3 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与冻存  46-47
    3.4 单克隆抗体纯度鉴定  47-48
    3.5 腹水蛋白质含量测定  48
    3.6 CPFX-McAb 效价测定  48-49
    3.7 CPFX- McAb 免疫球蛋白亚类鉴定  49
    3.8 单克隆抗体特异性分析  49-50
  4 讨论  50-55
    4.1 完全抗原免疫  50
    4.2 免疫原的纯度  50
    4.3 影响细胞融合的因素  50-51
    4.4 阳性杂交瘤细胞筛选方案  51-52
    4.5 杂交瘤细胞的阳性克隆化  52
    4.6 单克隆抗体细胞株冻存与复苏  52
    4.7 单克隆抗体制备  52-53
    4.8 单克隆抗体特异性  53-55
第三章环丙沙星ELISA 检测试剂盒的初步研制  55-66
  1 材料  55
    1.1 主要试剂与仪器设备  55
    1.2 主要溶液配制  55
  2 方法  55-57
    2.1 ELISA 基本程序  55
    2.2 最佳反应条件的确定  55-57
    2.3 ic-ELISA 标准工作曲线的建立  57
    2.4 LOD 的确定  57
    2.5 加标样品回收率的测定  57
  3 结果与分析  57-64
    3.1 最佳反应条件的确定  57-62
    3.2 ic-ELISA 标准工作曲线的建立  62-63
    3.3 LOD 的确定  63
    3.4 加标样品回收率的测定  63-64
  4 讨论  64-66
    4.1 药物小分子半抗原ELISA 检测方法的建立  64
    4.2 ELISA 检测效果的影响因素  64-65
    4.3 最低检测限  65
    4.4 实际样品回收率测定  65-66
第四章结论  66-67
参考文献  67-71
致谢  71

水产品中环丙沙星ELISA快速检测试剂盒的初步研制

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