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微囊藻毒素-LR酶联免疫法的开发研究

作　者: 张爱
导　师: 杨良
学　校: 云南大学
专　业: 生态学
关键词: 微囊藻毒素-LR 提取纯化完全抗原杂交瘤技术酶联免疫吸附(ELISA)
分类号: R115
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)建立于1971年,并用于医学研究。微囊藻毒素的ELISA分析国外应用得早一些,国内也有应用,但不如国外成熟。本文以微囊藻毒素-LR的酶联免疫分析作为探讨对象,内容包括微囊藻的毒素-LR的提取与纯化、微囊藻毒素-LR的完全抗原化、以及微囊藻毒素-LR单克隆抗体细胞株的筛选培养。(1)通过对从滇池捞取的新鲜藻样过筛选取、冷冻干燥制得蓝藻藻粉;用醋酸溶液破坏蓝藻细胞壁,使藻毒素溢出细胞;通过C18柱子的浓缩富集作用,用80%的甲醇溶液洗脱并收集藻毒素的提取液;对藻毒素提取液进行液相色谱分离分析,确定MC-LR保留时间为30min～31min,收集MC-LR分离液,浓缩、过C18柱纯化MC-LR,得到MC-LR粗提取液,在荧光硅胶薄层板的进一步精密分离下,得到MC-LR精制样品;通过液相色谱-质谱仪(LC-MS)鉴定,采用外标法计算,得到纯度为98.79%的MC-LR精制样品。本试验一共提取MC-LR精制样品6.4mg。(2)MC-LR的分子量为995.2D,是典型的半抗原。在免疫反应过程中,只有反应性没有免疫原性,为使MC-LR具有免疫原性,我们利用蛋白质的偶联技术,使其在动物免疫的过程中产生有效的免疫应答。本文首先用二巯基乙胺活化MC-LR,在MC-LR的第七位氨基酸脱氢丙氨酸的双键位置引入一个氨基,然后选用分子量为67000D的牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白,通过戊二醛两步法使MC-LR与BSA得到耦联。通过生物质朴法对中间产物H2N-etMC-LR的分子量进行了鉴定,确定MC-LR的活化很成功;分别通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术、基质辅助激光解析电离飞行时间质朴(MALDI-TOF-MS)检测,对偶联物MC-LR-BSA进行定性、定量鉴定。结果显示,耦联比在3～18:1之间,平均耦联比为8:1。(3)选用已鉴定的MC-LR-BSA免疫Balb/c实验小鼠,按100ug/只进行腹腔注射,加强免疫3～5次,每隔两周加强免疫一次,得到了效价为接近1:25600的血清。采用杂交瘤技术,取脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,用HAT选择性培养基进行选择培养,利用间接ELISA法筛选阳性细胞孔,将筛选出的阳性细胞进行细胞克隆欲获得稳定的细胞株,扩大培养。运用间接ELISA法测定MC-LR的最适包被浓度为10ng～20ng/孔。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-10
1 前言  10-23
  1.1 问题的提出  10-11
  1.2 现状及国内研究背景  11-19
    1.2.1 微囊藻毒素及污染现状  11-13
    1.2.2 研究背景  13-19
      1.2.2.1 微囊藻毒素提取的研究现状  13-16
        1.2.2.1.1 破损蓝藻细胞的方法  13-14
        1.2.2.1.2 溶剂萃取的主要体系  14
        1.2.2.1.3 固相萃取（SPE）  14-15
        1.2.2.1.4 固相微萃取（SPME）  15
        1.2.2.1.5 分离技术  15-16
      1.2.2.2 国内外微囊藻毒素分析方法进展  16-17
      1.2.2.3 酶联免疫检测在微囊藻毒素检测方法中的应用进展  17-19
        1.2.2.3.1 ELISA 及检测过程中的关键问题  17-18
        1.2.2.3.2 ELISA 的改进和发展  18-19
  1.3 研究意义  19-20
    1.3.1 各级环境监测站都有检测需要  19-20
    1.3.2 目前应用的HPLC 法――高价设备、前处理要求高、标准试剂品费用高  20
    1.3.3 ELISA 法简单易行，可作为是否实施HPLC 的前期试验  20
  1.4 研究难点  20-22
  1.5 技术路线  22-23
2 材料与方法  23-35
  2.1 材料  23-25
    2.1.1 实验仪器设备及耗材  23
    2.1.2 SDS-PAGE 电泳缓冲液准备  23-24
    2.1.3 ELISA 主要试剂配制  24
    2.1.4 细胞培养试剂系统  24-25
    2.1.5 实验动物及细胞  25
  2.2 方法  25-35
    2.2.1 MC-LR 的提取与纯化  25-26
      2.2.1.1 蓝藻样品的收集与预处理  25
      2.2.1.2 初步分离 MC-LR 色谱条件  25
      2.2.1.3 MC-LR 的纯化  25-26
      2.2.1.4 MC-LR 的鉴定及纯度测定  26
    2.2.2 完全抗原的合成  26-29
      2.2.2.1 合成原理  26-27
        2.2.2.1.1 MC-LR 完全抗原的人工合成  26-27
        2.2.2.1.2 产物的纯化及鉴定  27
      2.2.2.2 试验操作的具体过程  27-29
        2.2.2.2.1 微囊藻毒素的氨基活化  27
        2.2.2.2.2 戊二醛两步法合成微囊藻毒素完全抗原  27-29
    2.2.3 微囊藻毒素-LR 单克隆抗体细胞株系的研究  29-35
      2.2.3.1 实验原理  29
      2.2.3.2 动物免疫  29-30
      2.2.3.3 细胞融合  30-32
        2.2.3.3.1 骨髓瘤细胞的复苏与培养  30-31
        2.2.3.3.2 饲养细胞的制备  31
        2.2.3.3.3 细胞融合方法及具体步骤  31-32
      2.2.3.4 观察细胞生长情况  32
      2.2.3.5 杂交瘤细胞的筛选  32-33
        2.2.3.5.1 阳性细胞孔的筛选  32
        2.2.3.5.2 阳性细胞孔的进一步筛选  32-33
        2.2.3.5.3 阳性杂交瘤细胞的克隆和扩大培养  33
        2.2.3.5.4 细胞的冻存  33
      2.2.3.6 ELISA 检测方法的建立  33-35
        2.2.3.6.1 包被抗原最适浓度的确定  33-34
        2.2.3.6.2 血清效价的测定  34-35
3 实验结果与分析  35-49
  3.1 MC-LR 提取与分离实验结果  35-40
    3.1.1 初步分离MC-LR 色谱条件  35-36
    3.1.2 MC-LR 的鉴定结果  36-39
      3.1.2.1 MC-LR 定性鉴定结果  36-38
      3.1.2.2 MC-LR 纯度鉴定结果  38-39
      3.1.2.3 MC-LR 提取总量  39
    3.1.3 小结  39-40
  3.2 MC-LR 人工抗原的鉴定及结果  40-44
    3.2.1 H2N-etMC-LR 的鉴定及结果  40
    3.2.2 微囊藻毒素完全抗原的定性鉴定  40-41
    3.2.3 微囊藻毒素完全抗原的定量鉴定  41
    3.2.4 微囊藻毒素完全抗原研制的讨论  41-44
      3.2.4.1 MC-LR 的氨基衍生化  41-42
      3.2.4.2 戊二醛两步法合成微囊藻毒素人工抗原  42
      3.2.4.3 完全抗原的鉴定  42-44
  3.3 微囊藻毒素-LR 单克隆抗体细胞株系建立的结果  44-49
    3.3.1 包被抗原最适浓度的确定  44-45
    3.3.2 血清抗体效价的测定  45
    3.3.3 杂交瘤细胞株的建立  45-47
      3.3.3.1 阳性细胞孔的筛选  45-47
      3.3.3.2 阳性孔细胞的克隆和细胞保存  47
    3.3.4 小结与讨论  47-49
      3.3.4.1 包被抗原最适浓度的确定  47
      3.3.4.2 血清抗体效价的测定  47-48
      3.3.4.3 杂交瘤细胞株的建立  48-49
4 结论  49-51
5 总结与展望  51-53
参考文献  53-59
致谢  59

微囊藻毒素-LR酶联免疫法的开发研究

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