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混合皮肤移植中自体角朊细胞通过表达B7-H1而产生免疫抑制作用的相关研究

作　者: 柏莹
导　师: 曹颖平
学　校: 福建医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 角朊细胞 B7-H1 混合皮肤移植免疫抑制
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 3次
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内容摘要

目的建立MELC体系(体外模拟混合皮肤移植模型),探讨B7-H1分子在自体角朊细胞诱导的免疫抑制中的作用和相关机制。方法1.分离两只不同KM乳鼠(a,b乳鼠新生1-3日龄,无毛发生长)的淋巴细胞,表皮细胞,角朊细胞,并用细胞免疫组织化学方法鉴定角朊细胞。2.用分离的淋巴细胞,表皮细胞,角朊细胞,建立MELC体系。引入自体角朊细胞,在体外模拟自体皮岛效应。3.在有自体角朊细胞参与的与无自体角朊细胞参与的MELC体系中,分别混合培养12h,24h,36h后,分离角朊细胞,流式细胞术检测B7-H1的表达。同样条件下分离淋巴细胞,流式细胞术检测PD-1的表达。4.在有自体角朊细胞参与的与无自体角朊细胞参与的MELC体系中,分别混合培养12h,24h,36h后,分离淋巴细胞,提取RNA,实时荧光定量PCR检测IL-10,Foxp3,GATA-3 mRNA的表达。结果1.分离得到的淋巴细胞,表皮细胞活性好,存活率高。分离的角朊细胞纯度高,活性好,存活率高,采用细胞免疫组织化学鉴定,阳性率高。2.原代培养的角朊细胞,表皮细胞,淋巴细胞建立的MELC体系稳定,混合培养稳定。3.在有自体角朊细胞参与的MELC体系中,12h,24h,36h后,分离角朊细胞,流式细胞术检测B7-H1表达呈逐渐升高趋势,有显著差异(P<0.05)。同样条件下分离淋巴细胞,流式细胞术检测PD-1,表达呈升高趋势,有显著差异(P<0.05)。而无自体角朊细胞参与的MELC体系中,角朊细胞,淋巴细胞均无显著差异(P>0.05)。4.在有自体角朊细胞参与的MELC体系中,12h,24h,36h后,分离淋巴细胞,提取RNA,实时荧光定量PCR检测IL-10,Foxp3,GATA-3的表达呈升高趋势,有显著差异(P<0.05)。而无自体角朊细胞参与的MELC体系中,无以上表达趋势,均无显著差异(P>0.05)。结论1.混合皮肤移植中,自体角朊细胞可表达共刺激分子B7-H1,介导T细胞的活化,并伴随B7-H1受体PD-1在T淋巴细胞表面表达的上调。2. MELC体系中分泌的IL-10来源于淋巴细胞,并非角朊细胞。3. MELC体系中诱导出一群Foxp3+的调节性T细胞,负向调节免疫反应。4.自体角朊细胞通过表达B7-H1,使Th2细胞含量升高。

全文目录

缩略词简表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
正文  10
前言  10-12
材料和方法  12-21
  1 实验材料及试剂  12-14
    1.1 实验动物  12-13
      1.1.1 实验试剂  12-13
      1.1.2 引物合成  13
    1.2 主要仪器及耗材  13-14
  2 原代细胞的培养  14-21
    2.1 角朊细胞与表皮细胞的原代培养  14-15
    2.2 角朊细胞的传代培养  15
    2.3 角朊细胞的免疫组化鉴定  15-16
    2.4 淋巴细胞的原代培养  16
    2.5 体外混合皮肤移植模型（MELC 体系）的建立  16-17
    2.6 流式细胞术  17
      2.6.1 淋巴细胞表面 PD-1 表达的检测  17
      2.6.2 角朊细胞表面 B7-H1 表达的检测  17
    2.7 实时荧光定量  17-20
      2.7.1 相关器械，器皿的准备  17-18
      2.7.2 总 RNA 的提取  18-19
      2.7.3 RNA 样品测定  19
      2.7.4 逆转录合成cDNA  19
      2.7.5 PCR 扩增反应  19-20
      2.7.6 实时荧光定量 PCR 的质量控制  20
      2.7.7 PCR 反应扩增效率的监测  20
      2.7.8 PCR 扩增曲线分析  20
    2.8 分析及统计方法  20-21
结果  21-27
  1 细胞培养结果  21-22
    1.1 角朊细胞培养图片  21
    1.2 角朊细胞免疫组化鉴定  21
    1.3 表皮细胞的培养  21
    1.4 淋巴细胞的培养  21-22
  2 流式细胞术结果  22-24
    2.1 角朊细胞表面B7-H1 的表达  22
    2.2 MELC 体系中淋巴细胞PD-1 的表达  22-24
  3 Real-time PCR 反应结果  24-27
讨论  27-32
  1. 角朊细胞的培养及鉴定  27-28
  2. B7-H1 及其诱导的免疫抑制作用  28-30
  3. CD4 ~+CD25 ~+调节性 T 细胞的免疫抑制作用  30-32
结论  32-33
参考文献  33-36
致谢  36-37
硕士期间发表的论文  37-38
综述  38-44
  参考文献  42-44

混合皮肤移植中自体角朊细胞通过表达B7-H1而产生免疫抑制作用的相关研究

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