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可逆性永生化鼠源胰岛β细胞系的建立及生物学特性的研究

作　者: 蒋锦杏
导　师: 齐晖
学　校: 暨南大学
专　业: 免疫学
关键词: Tet-on advanced 慢病毒载体 SV40T抗原胰岛β细胞转染生物学特性
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的利用可调控的Tet-on advanced系统和SV40T基因构建永生化小鼠胰岛p细胞系,观察回复后胰岛p细胞生物学特性,评估可逆性永生化小鼠胰岛β细胞系回复后的安全性和功能性,为解决胰岛移植的细胞来源提供实验依据。方法采用Gateway基因重组技术,构建Tet-on advanced系统调控表达的慢病毒载体pLV.EX2d.P/puro-EF1 A>rtTA(M2)和pLV.EX3d.P/neo-TRE>SV40T>IRES/eGFP。脂质体lipotamin-2000转染法,将重组的两种慢病毒载体分别转染入包装细胞293FT,获得高滴度的病毒颗粒；再将病毒颗粒共同转染纯化培养的原代小鼠胰岛细胞,转染24小时后加入强力霉素诱导SV40T表达,48小时后加入嘌呤霉素和G418进行抗生素筛选获得体外扩增能力的永生化小鼠胰岛细胞,对多个永生化细胞克隆进行ELISA检测基础胰岛素分泌量,RT-PCR检测胰岛p细胞相关因子,筛选出有生理功能的可逆性永生化小鼠胰岛p细胞系。选取Tet-on调控下的RIB细胞株第10代细胞,去掉DOX诱导使永生化基因SV40T沉默而获得回复后的RIB细胞。通过RT-PCR及细胞免疫荧光技术检测回复前后SV40T及胰岛p细胞相关基因在mRNA和蛋白水平的表达；染色体核型分析、软琼脂克隆形成实验、细胞增殖试验和葡萄糖刺激胰岛素释放实验监测可逆性永生化胰岛β细胞在DOX调控前后的安全性和功能性变化。结果重组慢病毒载体pLV.EX2d.P/puro-EF 1 A>rtTA(M2)和pLV.EX3d.P/neo-TRE>SV40T> IRES/eGFP经PCR电泳检测显示构建成功,并验证了重组载体的正确性；分别转染包装细胞293FT,24小时后可见到转染pLV.EX3d.P/neo-TRE>SV40T>IRES/eGFP载体的293FT有绿色荧光表达,转染效率高达90%以上,48后小时收集两种病毒上清进行浓缩,经龙胆紫染色法检测病毒滴度分别能达到107和108；将获得的病毒颗粒同时转染小鼠原代胰岛细胞,转染后24小时加入DOX诱导,可见到处于终末分化状态的胰岛细胞有增殖现象,转染后48小时进行G418和嘌呤霉素的筛选,稳定转染的细胞继续增殖,余下细胞死亡；细胞克隆中经胰岛素ELISA检测阳性的有20株,再进行小鼠胰岛β细胞的相关基因RT-PCR检测,筛选到一株细胞克隆能表达Pdx、Nkx6.1、Pax6、Insulin胰岛β细胞相关基因,成功建立了可逆性永生化小鼠胰岛p细胞系(RIB系)。RIB系在有DOX诱导下增殖能力旺盛,去除DOX进行回复后的RIB细胞增殖速度减慢,5天后完全停止生长；RT-PCR及细胞免疫荧光检测RIB系在DOX诱导下SV40T基因和蛋白水平均有表达,去除DOX即在短期内停止增殖不表达SV40T,胰岛β细胞相关标志基因和蛋白在回复前后均有表达；回复前后的RIB细胞核型分析均为正常二倍体,平板克隆实验未见其致瘤性；RIB系葡萄糖刺激胰岛素释放实验胰岛素分泌能力较弱,回复后胰岛素分泌能力增强,但仍与原代胰岛细胞有差距,约为正常胰岛分泌量的1/3-1/2。结论利用Tet-on advanced系统调控的重组慢病毒载体pLV.EX2d.P/puro-EF1 A>rtTA(M2)和PLV.EX3d.P/neo-TRE>SV40T>IRES/eGFP成功建立的RIB系,其生存期延长,在体外增殖能力较强,且核型检测正常,胰岛β细胞相关基因和蛋白仍继续表达,回复后RIB细胞系停止增殖,不表达永生化基因SV40T,而胰岛素分泌能力增强,但分泌量仍与正常胰岛有差距。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章前言  10-12
第二章 Tet-on advanced系统调控的SV40T表达慢病毒载体的构建  12-37
  1 材料  12-15
  2 方法  15-27
    2.1 pLV.EX2d.P/puro-EF1A>rtTA(M2)载体的构建  15-21
    2.2 pLV.EX3d.P/neo-TRE>SV40T>IRES/eGFP载体的构建  21-26
    2.3 慢病毒载体扩增提纯备用转染  26-27
  3 结果  27-34
    3.1 pLV.EX2d.P/puro-EF1A>rtTA(M2)载体的构建  27-30
    3.2 pLV.Ex3d.P/neo-TRE>SV40T>IRES/eGFP表达载体的构建  30-34
    3.3 重组慢病毒载体的质量控制  34
  4 讨论  34-37
第三章 Tet-on系统调控的永生化小鼠胰岛β细胞系的建立  37-54
  1 材料  37-39
  2 方法  39-45
    2.1 Tet-on advanced调控的慢病毒载体的包装  39-41
    2.2 原代小鼠胰岛细胞的分离纯化与培养  41-42
    2.3 Tet-on advanced调控的永生化小鼠胰岛β细胞系的建立  42-45
  3 结果  45-51
    3.1 Tet-on advanced调控的慢病毒载体的包装  45-47
    3.2 原代小鼠胰岛细胞的分离纯化与培养  47-48
    3.3 Tet-on advanced调控的可逆性永生化小鼠胰岛β细胞系的建立  48-51
  4、讨论  51-54
第四章可逆性永生化小鼠胰岛β细胞系生物学特性研究  54-67
  1 材料  54-55
  2 方法  55-59
    2.1 可逆性永生化鼠源胰岛细胞系的安全性研究  55-58
    2.2 可逆性永生化鼠源胰岛细胞系的功能性研究  58-59
  3 结果  59-64
    3.1 回复前后的RIB细胞形态变化  59
    3.2 染色体稳定性检测  59-60
    3.3 RIB细胞增殖能力的测定  60-61
    3.4 Western Blot检测SV40T蛋白的表达水平  61
    3.5 平板克隆形成试验  61
    3.6 回复前后RIB细胞系胰腺相关基因表达  61-62
    3.7 回复前后RIB细胞系胰腺相关蛋白表达  62-63
    3.8 回复前后RIB细胞系葡萄糖刺激实验  63-64
  4 讨论  64-67
全文结论  67-68
参考文献  68-74
缩略语  74-75
综述  75-81
  参考文献  78-81
在校期间发表文章  81-82
致谢  82

可逆性永生化鼠源胰岛β细胞系的建立及生物学特性的研究

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