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苄嘧磺隆单克隆抗体的制备及应用初探

作　者: 玉晓微
导　师: 袁均林
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 苄嘧磺隆单克隆抗体间接竞争ELISA 农药残留检测
分类号: S482.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着科技水平的日益提高,使用农药已成为保障农业生产不可缺少的环节。农药通过对有害生物的防治和提高农副产品的产量、质量来改善人们的生活。目前,我国已经成为世界上第二大农药使用国,年消耗量估计在30万吨以上。近年来,由于有害生物抗药性的增强,使用农药的浓度和次数不断增加,导致有害物质大量残留在环境中,并通过食物链扩大污染,影响环境生态平衡。农药在人体内的积累和富集,能够引发各种疾病,直接影响到人类的健康。由农药残留引发的问题已经引起人们的高度重视。因此,建立一套简便、快速、灵敏的检测方法势在必行。目前,苄嘧磺隆(BSM)是农民使用最多的一种稻田除草剂。但是,长期大量地使用势必会导致该除草剂在环境中产生残留,危害整个生态系统的安全。因此对该除草剂进行实时监测是很有必要的。目前,检测苄嘧磺隆残留量的方法为传统的色谱法。虽然,色谱法较灵敏、准确,但是这种方法耗时长、检测程序繁琐、费用较高。而免疫学方法中的ELISA技术(酶联免疫吸附测定技术)却弥补了色谱法的缺点,它不但简便、快速、灵敏,而且可以大批量地检测样本。因此,该技术越来越多地被用于检测环境中的农药残留量。在本研究中,选择戊二醛作为偶联剂制备了苄嘧磺隆人工交联抗原BSM-OVA,经不同的方法鉴定抗原制备成功后,免疫BALB/c小鼠。第五次免疫后7天,测定小鼠的血清效价达到了1：1.28×105,IC50值为0.032μg·mL-1。采用PEG介导法将免疫后小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。经过筛选,得到一株苄嘧磺隆单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株,编号为2H1,分泌的抗体类型为IgG2b。采用体内诱生腹水法和辛酸—饱和硫酸铵法大量制备并纯化了苄嘧磺隆单克隆抗体。采用间接竞争ELISA方法测定了抗体的最佳工作条件,建立了利用单克隆抗体检测苄嘧磺隆残留量的间接竞争ELISA方法,制作了检测该除草剂的间接竞争ELISA标准曲线,得到回归方程y=13.816x+34.753,检测范围为1～1883ng-mL-1,最低检测限0.2ng·mL-1。苄嘧磺隆以浓度10-1～103ng·mL-1在东湖水样中添加,测得回收率为96.53%～107.2%,变异系数(CV)为3.711%-8.637%,数据表明该方法具有较高的精确度和灵敏度。利用该方法检测了某些粮谷类农作物样本中苄嘧磺隆的农药残留量,发现了部分样本中存在该除草剂的残留。本研究探索了一条利用免疫学方法检测苄嘧磺隆残留量的新途径,且与传统方法相比最大的特点快速、灵敏、可批量检测样本,在环境实时监测方面具有较大的应用价值,从而为人民健康提供一定的保障。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
1 文献综述  11-16
  1.1 除草剂的使用概况  11-12
  1.2 苄嘧磺隆的简介  12-13
  1.3 苄嘧磺隆农药残留现状及其危害  13
  1.4 苄嘧磺隆残留量检测分析现行方法  13-14
  1.5 免疫学技术测定苄嘧磺隆残留量的研究  14-15
  1.6 本研究的目的与意义  15
  1.7 创新点  15-16
2 材料和方法  16-28
  2.1 实验材料、试剂及仪器  16-18
    2.1.1 实验动物  16
    2.1.2 实验材料  16
    2.1.3 实验试剂  16
    2.1.4 主要溶液  16-17
    2.1.5 实验仪器、耗材  17-18
  2.2 实验方法  18-28
    2.2.1 苄嘧磺隆免疫抗原和包被抗原的制备  18
    2.2.2 交联抗原的鉴定  18-19
    2.2.3 人工抗原免疫小鼠  19
    2.2.4 抗血清效价、最佳稀释倍数及最适包被浓度的测定  19
    2.2.5 抗体灵敏度的测定  19-20
    2.2.6 杂交瘤细胞株的建立  20-22
    2.2.7 杂交瘤细胞抗体特性的鉴定  22
    2.2.8 体内诱生腹水法大量制备苄嘧磺隆单克隆抗体  22-23
    2.2.9 苄嘧磺隆单克隆抗体的纯化  23
    2.2.10 SDS-PAGE鉴定单克隆抗体纯化效果  23-24
    2.2.11 Folin—酚试剂法测定苄嘧磺隆单克隆抗体的浓度  24
    2.2.12 纯化苄嘧磺隆单克隆抗体最佳工作条件的测定  24-25
    2.2.13 制作检测苄嘧磺隆残留量的间接竞争ELISA标准曲线  25-26
    2.2.14 苄嘧磺隆单克隆抗体的应用  26-28
3 实验结果与分析  28-39
  3.1 交联抗原的鉴定  28-29
    3.1.1 紫外分光光度法分析  28
    3.1.2 SDS-PAGE电泳分析  28-29
  3.2 抗血清最佳稀释倍数及最适包被浓度的测定  29
  3.3 抗血清效价的测定  29-30
  3.4 抗体灵敏度的检测  30-31
  3.5 杂交瘤细胞株的建立  31-34
    3.5.1 脾细胞与骨髓瘤细胞的融合  31
    3.5.2 杂交瘤细胞的筛选及克隆化培养  31
    3.5.3 杂交瘤细胞的扩大培养  31-32
    3.5.4 杂交瘤细胞抗体特性的鉴定  32-34
  3.6 苄嘧磺隆单克隆抗体大量制备、纯化的结果  34
  3.7 纯化抗体特性的鉴定  34-36
    3.7.1 测定苄嘧磺隆单克隆抗体的浓度  34-35
    3.7.2 间接ELISA法测定苄嘧磺隆单克隆抗体最佳工作条件  35-36
  3.8 制作检测苄嘧磺隆残留量的间接竞争ELISA标准曲线  36-37
  3.9 苄嘧磺隆单克隆抗体的应用  37-39
    3.9.1 苄嘧磺隆在东湖水样中的添加回收试验  37
    3.9.2 水稻、大豆及小米中苄嘧磺隆残留量的检测结果  37-39
4 讨论  39-42
  4.1 人工抗原的制备  39
  4.2 间接ELISA测定  39
  4.3 细胞融合中SP2/0骨髓瘤细胞的制备  39-40
  4.4 抗体的大量制备及纯化  40
  4.5 检测BSM残留量的间接竞争ELISA方法的建立及应用探讨  40-42
5 结论  42-43
6 完善该研究的设想  43
7 创新点  43
8 实用性  43-44
9 潜在的经济效益  44-45
参考文献  45-48
在校期间论文发表情况  48-49
致谢  49-50
附录  50-62

苄嘧磺隆单克隆抗体的制备及应用初探

内容摘要

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