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鹿茸细胞端粒酶及其生长相关蛋白的检测与分析

作　者: 孙浩然
导　师: 张玉静
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 端粒酶 TERT DIGE 鹿茸 TRAP
分类号: Q952
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

端粒酶是一种特殊的逆转录酶,它拥有端粒酶RNA(Telomerase RNA, TR)组分和反转录酶(Telomerase reverse transcriptase, TERT)组分,它能以自身的TR为模板,在端粒末端反转录延长端粒重复序列,补充因细胞的连续分裂导致的端粒缺失,抑制细胞进入衰老期,从而使细胞能持续的进行分裂增殖,是细胞能够永生化的的动力源泉。端粒酶在大部分正常的体细胞中活性受到明显的抑制,而在大多数的肿瘤细胞,干细胞和生殖细胞等增殖旺盛的细胞中则可检测到高活性的端粒酶。鹿茸角是唯一一种能够完全再生的哺乳动物器官,它每年周期性的进行着脱落与再生的循环,生长过程中由于意外而折断也可在其断处重新生长。它还是哺乳动物中生长最快的组织,他从开始发育到最终成熟只需80-90天。在其生长最旺盛阶段,每天可生长1-2cm。研究表明,鹿茸的快速生长依赖于其顶端增殖区细胞的高速增殖,在鹿茸的快速生长阶段,增殖区细胞的分裂增殖速度是癌细胞的30倍。鹿茸的生长发育是在一种复杂的调控网络下进行的,虽然已经陆续发现IGF-1, PEDF, PTHrP和Wnt信号通路等参与调控鹿茸的生长发育。但目前,鹿茸生长发育的调控机制仍然不清楚,依然只处于研究的初级阶段。端粒酶作为一种维持细胞快速生长的逆转录酶,其是否在鹿茸的快速生长中发挥作用,目前尚未见报道。本研究以鹿茸为研究对象,应用改进的TRAP(?)去检测了鹿茸增殖区的各组织层细胞在鹿茸生长期端粒酶的活性,并结合Bandscan软件进行分析,结果表明,在增生区的间充质层细胞中检测到的端粒酶活性最高,相对活性达到91.2；前软骨层细胞次之,为46.4；而在软骨层细胞的相对活性只有9.1,在钙化软骨层组织中则检测不到端粒酶活性。端粒酶活性在各组织层中的呈现递减趋势,且随着细胞分化程度的增高,端粒酶的活性逐渐降低。采用RT-PCR法检测了与端粒酶活性正相关的TERT基因在各组织层细胞中的相对表达量,结果显示在各组织层中TERT表达量变化趋势与相对活力变化趋势相一致,验证了TRAP结果的可信靠性。鹿茸的生长是以一种特殊的软骨内成骨方式进行的,增殖区的间充质层为鹿茸生长程中的干细胞储备层。正是间充质层细胞的高速增殖并不断的分化成不同程度的软骨细胞才促成了鹿茸的高速生长。为进一步探索鹿茸生长发育的分子机制,本研究应用双向差异荧光凝胶电泳(2D-DIGE)技术联合质谱分析,对间充质层组织与其毗邻的前软骨层组织中差异表达的蛋白进行了分析,旨在从中发现新的与鹿茸生长相关的蛋白。经软件分析后发现了28个差异表达的蛋白,并成功的鉴定了其中的12个蛋白,其中有7个蛋白在间充质层中表达上调,包括凋亡蛋白bax, F-box protein 22,剪接蛋白ZRANB2,转录因子GATA-6,古洛糖酸内酯氧化酶,NPC1蛋白,NADH脱氢酶。5个表达下调蛋白,包括囊性纤维化跨膜转运调节体(CFTR),Ⅲ型胶原蛋白,β-微管蛋白,细胞角蛋白,CD38蛋白。其中转录因子GATA-6, F-box22和剪接蛋白ZRANB2是首次在鹿茸中被检测到,它们可能在鹿茸的生长发育中发挥重要的作用。本研究首次证实了在鹿茸生长旺盛时期,端粒酶在鹿茸生长顶端增生区的各组织层中表达,各组织层中相对端粒酶活性各不相同,且随着细胞分化程度的增高,端粒酶的活性逐渐降低,说明端粒酶可能参与鹿茸细胞的增殖与分化,可能是鹿茸生长快速的原因之一。并首次采用2D-DIGE技术对鹿茸生长发育的关键部位间充质层与前软骨层差异表达的蛋白进行了分析与鉴定,发现了一些在鹿茸发育过程中未见报道的分子,它们可能在鹿茸的生长发育过程中发挥重要作用。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
英文缩写词表  10-11
前言  11-13
第一篇文献综述  13-35
  第一章端粒酶研究进展  13-25
    1.1 端粒保护染色体机制  13-15
    1.2 端粒酶结构  15-17
    1.3 端粒酶调控机制  17-20
    1.4 端粒酶检测方法  20-25
  第二章鹿茸发育研究进展  25-35
    2.1 鹿茸脱落—再生循环  25-26
    2.2 角柄与初角茸发育  26-27
    2.3 鹿茸的脱落  27-28
    2.4 再生鹿茸的细胞起源  28-29
    2.5 鹿茸生长发育调控  29-33
    2.6 鹿茸再生模式的争议  33-35
第二篇研究内容  35-72
  第一章鹿茸细胞端粒酶活性检测  35-51
    1.1 材料与方法  35-43
    1.2 结果  43-46
    1.3 讨论  46-49
    1.4 小结  49-51
  第二章鹿茸生长相关蛋白的检测与分析  51-72
    2.1 材料与方法  51-56
    2.2 结果  56-64
    2.3 讨论  64-70
    2.4 小结  70-72
结论  72-73
参考文献  73-92
攻读学位期间所发表的学术论文  92-93
致谢  93

鹿茸细胞端粒酶及其生长相关蛋白的检测与分析

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