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水仙内生真菌的分离纯化及其次生代谢产物生物活性研究

作　者: 姚广玉
导　师: 杨林；杨明俊
学　校: 兰州理工大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 水仙内生真菌抗肿瘤抑菌 AChE抑制活性分子生物学鉴定次级代谢产物
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

植物内生真菌(Endophytic fungi)作为一类特殊生境的微生物资源,广泛分布于苔藓植物、蕨类植物、裸子植物以及被子植物类群中,经过与宿主植物的长期协同进化,它们能够产生与宿主植物结构相同或相似的化学物质,并且许多化合物拥有新颖的结构骨架。鉴于此特点,本文以富含生物碱类物质的石蒜科(Amaryllidaceae)水仙属(Narcissus L.)植物水仙(Narcissus tazetta L. var. chinensis Roem.)为材料,首次对其内生真菌及其生物活性进行了初步研究,取得以下成果:1.通过对水仙组织表面消毒剂和消毒方案的考察,确定出分离水仙内生真菌的2种消毒方案:①75%酒精浸泡60 s→无菌水冲洗3次→5%次氯酸钠浸泡5 min→无菌水冲洗3次;②75%酒精浸泡60 s→无菌水冲洗3次→0.1%升汞浸泡1 min→无菌水冲洗3次。从水仙植物根、鳞茎、叶三种器官组织中共分离得到18株内生真菌,其中来源于根16株、鳞茎2株、叶0株,这些菌株菌落形态多样,通过对各菌株形态学的初步观察确定,这些内生真菌大多为半知菌类(Fungi Imperfecti),少部分为子囊菌类(Ascomycota)。2.运用MTT法、滤纸圆片法以及改良的Ellman方法,对所筛选到的18株内生真菌发酵产物进行抗肿瘤、抑制病原菌以及AChE抑制活性的检测。抗肿瘤结果显示,其中有4株内生真菌的发酵产物对人肝癌细胞株HepG2的增殖具有较好的抑制作用,它们的菌株编号为SX-R201、SX-R202、SX-R203、SX-R204,在样品浓度为1mg/mL下,对HepG2的抑制率依次为86.0%、89.8%、62.9%、90.6%。抑菌结果显示,在18个测试样品中,有15个至少对1种指示细菌的生长具有抑制作用,占样品总数的83.3%,其中对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)具抑制作用的样品有5个,占总数的27.8%;对大肠杆菌(Escherichia coli)具有抑制作用的样品有8个,占总数的44.4%;对肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)具有抑制作用的有2个,占总数的11.1%;对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)具抑制作用的有8个,占测试总数的44.4%。AChE抑制活性结果显示,在样品浓度为1mg/mL下,有11株表现出了阳性结果,占总数61.1%,其中有3株抑制率大于50%,编号依次为SX-R101、SX-S101和SX-S102,IC50分别0.4562mg/mL、0.3897 mg/mL、0.4122 mg/mL。3.采用分子生物学方法,对具较好AChE抑制活性菌株SX-S101的ITS序列进行分析,Blast比对结果显示其和Rhinocladiella sp. LA60的同源度为98%,确定SX-S101菌株为子囊菌纲(Ascomycetes)喙枝孢霉属(Rhinocladiella)菌株Rhinocladiella sp. LA60。进一步对其进行大批量发酵,分离次级代谢产物,最终从发酵液乙酸乙酯萃取物中分离得到2个单体化合物R.sp-cp-1(77.6mg)和R.sp-cp-2(7.5mg),但对AChE抑制活性检测结果显示,它们没有表现出抑制活性。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-12
第1章绪论  12-26
  1.1 植物内生真菌研究概况  12-23
    1.1.1 内生真菌的定义  12-13
    1.1.2 内生真菌的起源与演化  13-14
    1.1.3 植物内生真菌与宿主植物之间的关系  14-15
    1.1.4 植物内生真菌的生物学意义  15-17
    1.1.5 内生真菌的普遍存在性与生物多样性  17-18
    1.1.6 植物内生真菌产活性物质研究概况  18-21
    1.1.7 植物内生真菌产生与宿主相同或类似活性成分的机制初探  21-22
    1.1.8 内生真菌研究内容、存在问题与展望  22-23
  1.2 水仙属植物研究现状  23-25
    1.2.1 水仙属植物及水仙概况  23-24
    1.2.2 水仙属植物研究现状与前景展望  24-25
  1.3 本课题的研究内容、目的和意义  25-26
第2章水仙内生真菌的分离纯化及形态学观察  26-34
  2.1 实验材料  26-27
    2.1.1 植物材料  26
    2.1.2 药品与仪器  26
    2.1.3 培养基  26-27
  2.2 实验方法  27-28
    2.2.1 水仙植物组织表面消毒效果检验及方案的确定  27
    2.2.2 水仙内生真菌的分离纯化与保存  27-28
    2.2.3 水仙内生真菌的形态学观察及初步鉴定  28
  2.3 结果与分析  28-32
    2.3.1 表面消毒方案的确定  28-29
    2.3.2 水仙内生真菌的分离  29-30
    2.3.3 水仙内生真菌的形态学观察和初步归类  30-32
  2.4 讨论  32-34
第3章水仙内生真菌抗肿瘤、抑菌及AchE 抑制活性研究  34-43
  3.1 引言  34
  3.2 实验材料  34-35
    3.2.1 菌株及细胞株  34
    3.2.2 培养基  34-35
    3.2.3 试剂、药品及仪器  35
  3.3 实验方法  35-38
    3.3.1 内生真菌的发酵培养及供试样品的制备  36
    3.3.2 抗肿瘤活性的检测  36-37
    3.3.3 抑菌活性的检测  37
    3.3.4 AChE 抑制活性检测  37-38
  3.4 结果与分析  38-42
    3.4.1 抗肿瘤活性结果  38-39
    3.4.2 抑菌活性结果  39-40
    3.4.3 AChE 抑制活性测定结果  40-42
  3.5 讨论  42-43
第4章 SX-S101 菌株的分子生物学鉴定及次级代谢产物研究  43-52
  4.1 实验材料  43-44
    4.1.1 菌株及培养基  43
    4.1.2 药品试剂  43-44
    4.1.3 实验仪器  44
  4.2 实验方法  44-47
    4.2.1 SX-S101 菌株菌落形态及显微结构观察  44-45
    4.2.2 SX-S101 菌株分子生物学鉴定  45-46
    4.2.3 SX-S101 菌株不同生长阶段代谢产物对AChE 抑制程度  46
    4.2.4 SX-S101 的大量发酵及其发酵液次级代谢产物的分离纯化  46-47
  4.3 结果与分析  47-50
    4.3.1 SX-S101 菌落形态及显微形态观察  47-48
    4.3.2 分子生物学方法对SX-S101 菌株的分析鉴定  48-49
    4.3.3 SX-S101 菌株生物量的积累与AChE 抑制活性关系  49-50
    4.3.4 SX-S101 次级代谢产物的分离纯化与AChE 抑制活性检测  50
  4.4 讨论  50-52
结论与展望  52-54
参考文献  54-59
致谢  59-60
附录A （攻读硕士学位期间所发表的论文及成果）  60

水仙内生真菌的分离纯化及其次生代谢产物生物活性研究

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