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跨膜蛋白免疫抑制域在ALV感染中的作用研究

作　者: 王晓伟
导　师: 成子强
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 禽白血病病毒跨膜蛋白 ISU肽多克隆抗体病毒抑制
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

禽白血病(avian leukosis,AL)是指由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽白血病病毒(ALV)引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的一类可传染的肿瘤性疾病,可划分为A-J 10个亚群。其中J亚群禽白血病病毒(ALV-J)是由内源性和外源性ALV重组而来,自发现以来给养禽业造成了巨大的经济损失。一直以来,由于ALV病毒群的多样性、病毒自身的高变异性以及引起疾病的复杂性,对ALV防治的研究未见显著成效,至今无控制ALV感染的有效方法、药物和疫苗。ALV的囊膜蛋白由表面蛋白(SU)和跨膜蛋白(TM)组成。SU具有受体结合功能,诱导宿主产生抗体,但由于SU非常容易发生变异,使病毒可成功逃避抗体的中和作用,因此,以病毒SU为靶标至今未能研制有效的疫苗和药物。而TM在病毒-细胞融合中的关键作用引起了科学家的高度关注。在SU与受体结合后,TM发生了一系列分子构象变化,以促进病毒-细胞的融合。近年来研究证实,反转录病毒与宿主细胞融合后,会引起宿主细胞的严重免疫抑制,继而诱发产生肿瘤。研究发现,引起免疫抑制的关键蛋白(肽)可能来自于TM中的高度保守序列(域)。为解析TM内高度保守序列在病毒感染中的作用,本研究通过比较J亚群英国毒株HRPS-103、中国毒株NX0101、美国毒株ADOL-7501、A亚群MAV-1、B亚群MAV-2、C亚群RSV-Prague C、D亚群RSV-Schmidt-Ruppin D以及E亚群RAV-0A1之间TM蛋白内高度保守序列,确定了27个氨基酸序列:LQNRAAIDFLLLAQGHGCQDVEGMCCF,位于TM蛋白内融合肽与跨膜域之间,具有螺旋的二级结构,合成的小肽分子量约为2953.46 Da,经高效液相色谱法分析纯化,命名为ISU。ISU肽的体外免疫活性试验显示,ISU肽与ALV-J相似,均可明显抑制体外淋巴细胞的生长、分裂。为进一步证明ISU肽的免疫抑制功能,我们以ISU肽多克隆抗体解除ALV-J免疫抑制的方法进行验证。将ISU小肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫兔制备多克隆抗体。通过ELISA检测抗体效价(灵敏性),Western blot检测特异性,间接免疫荧光(IFA)观察多抗与ALV-J感染细胞/正常细胞作用位点,荧光定量PCR法检测多抗解除ALV-J免疫抑制的效果。结果显示,获得的27个保守氨基酸合成的小肽(ISU肽)与KLH偶联后可有效地激发兔产生高效价多克隆抗体,并能特异性识别ISU肽;IFA检测发现,多抗可以和ALV-J竞争性结合于细胞核;荧光定量PCR检测病毒RNA发现,多抗可完全抑制ALV-J在DF-1中的复制,抑制病毒复制有效剂量实验说明病毒复制和多抗接种剂量存在负相关性。本研究不但证明ALV TM内的高度保守序列具有强烈的免疫抑制功能,而且为防治禽白血病及相关反转录病毒提供了新的有效途径和可借鉴的方法。

全文目录

中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
1 引言  13-30
  1.1 禽白血病病毒的研究现状  13-26
    1.1.1 禽白血病的介绍和发展历史  13-14
    1.1.2 AL 对养禽业的危害  14
    1.1.3 ALV 的流行病学  14-16
      1.1.3.1 传播途径  14-15
      1.1.3.2 流行特点  15-16
    1.1.4 ALV 病理学  16
      1.1.4.1 临床症状  16
      1.1.4.2 组织学变化  16
    1.1.5 AL 诊断  16-18
    1.1.6 AL 目前的防治手段  18-19
    1.1.7 ALV 的免疫抑制  19-21
      1.1.7.1 免疫抑制的主要机理  19-20
      1.1.7.2 免疫抑制的临床症状  20
      1.1.7.3 免疫抑制的危害  20-21
    1.1.8 ALV 的分子病毒学特性  21-23
    1.1.9 跨膜蛋白在膜融合过程中的作用  23-25
      1.1.9.1 病毒受体  23-24
      1.1.9.2 融合肽  24
      1.1.9.3 膜融合过程  24-25
    1.1.10 跨膜蛋白疏水区在病毒感染过程中发挥重要作用  25
    1.1.11 跨膜蛋白（TM）内免疫抑制域引起宿主免疫抑制  25-26
    1.1.12 ALV 内跨膜蛋白免疫抑制域的研究现状  26
  1.2 流式细胞术  26-28
    1.2.1 流式细胞仪的基本结构和工作原理  27
    1.2.2 流式细胞术在临床上的应用  27-28
  1.3 T 淋巴细胞亚群  28-29
  1.4 荧光定量PCR  29-30
2 材料与方法  30-41
  2.1 试剂与仪器  30-33
    2.1.1 主要试剂  30-33
    2.1.2 主要仪器  33
  2.2 方法  33-41
    2.2.1 ALV TM高度保守区氨基酸序列的确定、合成  33
    2.2.2 淋巴细胞制备  33-34
    2.2.3 ISU 肽免疫活性实验  34
    2.2.4 流式细胞术检测ISU 肽免疫活性  34
    2.2.5 兔抗ISU 小肽血清的制备  34
    2.2.6 多克隆抗体效价检测  34-35
    2.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）  35-36
    2.2.8 Western blot  36-37
    2.2.9 间接免疫荧光(IFA)  37-38
    2.2.10 兔抗ISU 肽多抗体外抑制病毒复制实验  38
      2.2.10.1 ALV-J NX0101 病毒TCID50 的测定  38
      2.2.10.2 体外抑制病毒复制实验  38
    2.2.11 细胞RNA 提取和反转录PCR  38-40
      2.2.11.1 细胞RNA 提取  38-39
      2.2.11.2 反转录PCR  39-40
    2.2.12 荧光定量PCR  40
    2.2.13 兔抗ISU 肽多抗抑制病毒复制有效剂量实验  40-41
3 结果  41-49
  3.1 ALV TM高度保守氨基酸序列的确定及其基本特性  41-43
  3.2 ISU 肽免疫活性检测  43-44
  3.3 抗 ISU 肽多抗效价及其特异性检测  44-45
  3.4 多抗与细胞结合的特异性位点  45-46
  3.5 兔抗ISU 小肽多抗体外抑制病毒复制  46-49
    3.5.1 ALV-J NX0101 TCID50 测定结果  46-47
    3.5.2 体外抑制病毒复制实验  47-49
4 讨论  49-51
5 创新  51-52
参考文献  52-61
致谢  61-62
作者简介及攻读硕士期间发表论文  62-63
硕士学位论文内容简介及自评  63

跨膜蛋白免疫抑制域在ALV感染中的作用研究

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