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多粘类芽孢杆菌SC2的全基因组测序

作　者: 王翠翠
导　师: 杜秉海；李俊
学　校: 山东农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 多粘类芽孢杆菌基因组测序比较基因组学功能基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SC2是一株分离自辣椒根际的广谱拮抗菌,并具有较好的植物促生及溶磷、解钾能力。本研究将传统Sanger测序方法与454高通量测序相结合,利用Newbler Phred/Phrap/consend软件进行基因组序列拼接,同时进行必要的PCR重复测序以校正序列,最终获得多粘类芽孢杆菌SC2基因组序列完成图谱。结果显示SC2的基因组由1条染色体和1个质粒组成,其中染色体的长度为5731683bp,G+C含量为45.24%;质粒的长度为510115bp,G+C含量为37.61%。建立生物信息学软件分析系统,使用Glimmer3对全基因组序列进行开放阅读框(ORFs)的预测,染色体及质粒分别编码5385个及647个ORF开放阅读框;使用tRNAscan-SE程序对染色体及质粒基因组序列进行扫描,发现并注释可能的tRNA数量分别为110和44个;使用RepeatMasker定位重复区域。使用Rbsfinder程序进行核糖体结合位点的预测,并获得14套16S/23S/5S rRNA操纵子区域。下载GenBank上的nr数据库、Swiss-Prot蛋白数据库,COG、CDD和String数据库,InterPro整合数据库等,对基因功能进行预测及分类信息、结构域信息的二次注释。与其他已测序的类芽孢杆菌属基因组不同的是,菌株SC2含有一个质粒。将注释结果提交GenBank,获得多粘类芽孢杆菌SC2染色体及质粒的序列登录号分别为CP002213和CP002214。菌株SC2的染色体编码了许多与抗生素合成相关的基因,如Macrolactin,Bacillaene,Fusaricidin,Iturin,Polyketide,Gramicidin S,Polymyxin。这些抗生素大多是通过非核糖体途径合成的非核糖体肽或聚酮化合物。这些可能的编码抗生素基因的存在,以及非核糖体肽或聚酮化合物本身所具有的多样,稳定等特性及其合成途径的特殊性,解释了SC2具有广谱抗菌活性的原因。利用KEGG代谢数据库对所有注释功能的基因进行代谢途径的归类,除获得了基础代谢途径外,还获得了Macrolactin,Bacillaene和IAA的代谢通路。通过比较基因组学手段,研究多粘类芽孢杆菌SC2与近缘已测序的类芽孢杆菌及芽孢杆菌基因组之间的差异。以绿色荧光蛋白为报告基因,构建大肠杆菌-多粘类芽孢杆菌穿梭表达载体,对Fusaricidin synthetase基因的可能启动子进行了鉴定,但GFP报告基因未表达。多粘类芽孢杆菌SC2全基因组序列的测序及比较基因组学分析研究,将会为后续功能基因组学研究,如转录组学、蛋白质组学、代谢组学和RNA组学研究,提供坚实的数据和理论依据,促进多粘类芽孢杆菌活性物质的表达调控机制研究,对加快并扩大其在工农业生产中的应用,具有重要意义。

全文目录

中文摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-34
  1.1 微生物基因组学  12-22
    1.1.1 微生物基因组学发展历史  12-13
    1.1.2 微生物基因组学研究进展  13-22
      1.1.2.1 已完成测序基因组（微生物）  13-15
      1.1.2.2 基因组学分类  15-17
      1.1.2.3 微生物基因组学研究热点  17-19
      1.1.2.4 测序技术  19-22
  1.2 类芽孢杆菌属全基因组研究现状  22-31
    1.2.1 多粘类芽孢杆菌的分类地位  22-23
    1.2.2 多粘类芽孢杆菌及其应用  23-31
      1.2.2.1 抗菌物质  23-27
      1.2.2.2 NRPS-PKS 合成途径  27-29
      1.2.2.3 农业应用  29-30
      1.2.2.4 工业应用  30-31
      1.2.2.5 医药应用  31
  1.3 多粘类芽孢杆菌SC2 的特性  31-32
  1.4 立题依据、研究内容及技术路线  32-34
    1.4.1 立题依据  32
    1.4.2 研究内容  32-33
    1.4.3 技术路线  33-34
2 材料与方法  34-51
  2.1 溶磷、解钾能力测定  34-36
    2.1.1 试验材料  34-35
      2.1.1.1 菌株  34
      2.1.1.2 培养基  34
      2.1.1.3 溶磷试验试剂  34-35
      2.1.1.4 解钾试验试剂  35
      2.1.1.5 仪器  35
    2.1.2 钼锑抗比色法测定菌株溶磷能力  35-36
    2.1.3 原子吸收分光光度计法测定菌株解钾能力  36
  2.2 多粘类芽孢杆菌SC2 全基因组序列测定  36-41
    2.2.1 材料  36-39
      2.2.1.1 菌株  36
      2.2.1.2 培养基  36-37
      2.2.1.3 质粒载体  37
      2.2.1.4 工具酶及DNA 分子量标准  37
      2.2.1.5 各种试剂盒  37-38
      2.2.1.6 主要化学试剂  38
      2.2.1.7 主要仪器及设备  38-39
    2.2.2 方法  39-41
      2.2.2.1 鸟枪法基因组文库的构建  39
      2.2.2.2 基因组文库的大规模测序  39
      2.2.2.3 序列的空缺填补  39-40
      2.2.2.4 基因组序列的拼接  40-41
  2.3 多粘类芽孢杆菌全基因组注释  41-44
    2.3.1 开放阅读框（ORF）的预测  41
    2.3.2 基因功能注释  41
    2.3.3 其他元件注释  41
    2.3.4 代谢网络分析  41-42
    2.3.5 全基因组多序列比对  42
    2.3.6 参照序列及软件  42-44
  2.4 Fusaricidin synthetase 启动子鉴定  44-51
    2.4.1 材料  44-45
      2.4.1.1 菌株和质粒  44
      2.4.1.2 培养基  44
      2.4.1.3 生化试剂  44-45
      2.4.1.4 主要仪器设备  45
    2.4.2 方法  45-51
      2.4.2.1 目的片段的克隆  45-50
      2.4.2.2 重组表达质粒及基因工程菌的构建  50-51
3 结果与分析  51-65
  3.1 多粘类芽孢杆菌SC2 溶磷、解钾能力  51-52
    3.1.1 溶磷能力  51
    3.1.2 解钾能力  51-52
  3.2 多粘类芽孢杆菌SC2 全基因组序列测定  52
    3.2.1 基因组序列的破译  52
      3.2.1.1 文库构建及数据  52
      3.2.1.2 序列拼接  52
  3.3 多粘类芽孢杆菌SC2 全基因组序列注释  52-60
    3.3.1 SC2 基因组注释  52-53
    3.3.2 全基因组完成图谱  53-55
    3.3.3 三株芽孢杆菌基因组进化关系及基本特征的比较  55-57
    3.3.4 多粘类芽孢杆菌 SC2 抗病促生相关基因及产物  57-60
      3.3.4.1 功能基因比较列表  57-58
      3.3.4.2 多种抗生素合成及促生相关基因  58-59
      3.3.4.3 代谢网络  59-60
  3.4 Fusaricidin synthetase 启动子鉴定  60-65
    3.4.1 目的片段的克隆  60-63
    3.4.2 绿色荧光蛋白表达载体的构建与表达  63-65
4 讨论  65-68
5 结论  68-69
参考文献  69-83
附录  83-95
致谢  95-96
攻读学位期间发表论文情况  96

多粘类芽孢杆菌SC2的全基因组测序

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