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氧自由基对大鼠小肠上皮细胞的损伤及硫辛酸的干预研究

作　者: 王啸春
导　师: 徐建雄
学　校: 上海交通大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 大鼠肠上皮细胞原代培养氧化应激硫辛酸干预
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:本试验通过体外培养大鼠小肠上皮细胞（IEC）,建立黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤（XO/X）和过氧化氢（H2O2）对IEC氧化损伤模型,研究不同氧自由基对小肠上皮细胞损伤与功能的关系,以及硫辛酸（LA）对XO/X与H2O2氧化胁迫下IEC的干预作用。方法:实验一:对原代培养大鼠IEC的分离方法做出改进与简化:联合运用300 U/mL胶原酶Ⅺ和100 mg/ml中性蛋白酶I分离新生大鼠小肠,可得到完整隐窝单位和少数单个小肠上皮细胞,在5%FBS-DMEM/F12生长培养基中,3-4d形成细胞集落,7-8d细胞汇合需要传代,用0.05% Trypsin-EDTA消化细胞,传代后细胞增殖能力较强,运用刮除法和相差消化相差贴壁法进行纯化,经免疫组化法鉴定能够得到纯度80%以上的小肠上皮细胞,为研究营养素对肠上皮细胞的作用提供了理想的体外模型。实验二:XO/X与H2O2损伤IEC模型的建立:以不同浓度的XO/X（ 5、10、50、100、200U/L XO和10μmol/L X）和不同浓度的H2O2 （0.1μmol/L、1μmol/L、2.5μmol/L、10μmol/L、30μmol/L、100μmol/L和1mmol/LH2O2）,分别作用IEC细胞3、12、24、48h,以四唑盐（MTT）比色法检测细胞活力氧化,确定XO/X和H2O2损伤模型适宜损伤浓度和损伤时间。实验三:XO/X和H2O2氧化胁迫模型下大鼠IEC损伤与修复及LA的干预作用:XO/X模型下,空白对照组:细胞正常培养24h; XO/X损伤组:细胞中加入50U/L XO,10μmol/L X后,培养24 h; XO/X+LA药物组:细胞与不同浓度的LA（0.lμg/ml、1μg/ml和10μg/ml）预孵3 h,再加入50U/L XO培养24h。H2O2模型下:空白对照组:细胞正常培养24h; H2O2损伤组:加入100μmol/L H2O2后,培养24 h; H2O2+LA药物组:细胞与不同浓度的LA（0.lμg/ml、1μg/ml和10μg/ml）预孵3 h,再加入100μmol/L H2O2培养24 h,分别测定LA对各组细胞活力,IEC抗氧化指标（SOD、GSH-pX和MDA）、功能酶（脂肪酶、淀粉酶）、肠道损伤特异性指标（DAO和LDH）的影响。结果:1. XO/X损伤IEC模型的适宜浓度为50U/L XO和10μmol/L X,适宜培养时间为24h; H₂O₂损伤IEC模型的适宜浓度为100μmol/ml H₂O₂,适宜培养时间为24h。2. XO/X（50U/L XO/10μmol/L X）与H₂O₂（100μmol/ml）氧化胁迫下的IEC,细胞活力显著下降（P<0.05）,IEC的SOD、GSH-pX、脂肪酶、淀粉酶、二胺氧化酶活性显著下降（P<0.05）,细胞培养液中MDA含量显著上升（P<0.05）;且50U/L XO对IEC造成的氧化损伤相较100umol/ml的H₂O₂严重。3. LA可以促进IEC的增殖,显著提高XO/X与H₂O₂两种模型氧化胁迫下IEC的SOD、GSH-pX活性,降低细胞培养液中MDA的含量（P<0.05）;同时LA提高了氧化胁迫下IEC分泌的淀粉酶（P<0.05）和脂肪酶（P>0.05）的活性;显著降低了氧化胁迫下IEC培养液中LDH的活性,提高了IEC裂解液和培养液中DAO的活性。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章前言  12-26
  1.1 动物肠道氧化损伤的机制  12-13
    1.1.1 自由基与肠道缺血性再灌注损伤  12-13
    1.1.2 自由基与炎症性肠病  13
  1.2 小肠上皮细胞培养的研究进展  13-17
    1.2.1 小肠上皮细胞的结构及其功能  14
    1.2.2 原代培养小肠上皮细胞的分离纯化  14-17
  1.3 抗氧化剂对动物肠道氧化应激干预作用的研究进展  17-24
    1.3.1 维生素C  17-18
    1.3.2 维生素E  18-19
    1.3.3 N-乙酰半胱氨酸，半胱氨酸，谷胱甘肽  19-20
    1.3.4 硫辛酸  20-21
    1.3.5 复合抗氧化剂  21-22
    1.3.6 天然植物及其有效成分  22-23
    1.3.7 小结  23-24
  1.4 立题依据  24-26
    1.4.1 研究目的与意义  24
    1.4.2 研究内容  24-26
第二章大鼠小肠上皮细胞的分离与原代培养  26-40
  2.1 试验材料  26-28
    2.1.1 主要试剂  26
    2.1.2 试验仪器  26-27
    2.1.3 材料制备  27-28
  2.2 试验方法  28-31
    2.2.1 大鼠小肠上皮细胞的分离  28-29
    2.2.2 大鼠IEC 的纯化  29
    2.2.3 大鼠IEC 的鉴定  29-30
    2.2.4 大鼠IEC 的传代  30
    2.2.5 大鼠IEC 的细胞生长曲线  30
    2.2.6 统计方法与作图  30-31
  2.3 结果和分析  31-36
    2.3.1 大鼠IEC 的分离方法  31-33
    2.3.2 大鼠IEC 的纯化  33
    2.3.3 大鼠IEC 的鉴定  33-35
    2.3.4 大鼠IEC 的传代  35
    2.3.5 大鼠IEC 的生长曲线  35-36
  2.4 讨论  36-39
    2.4.1 组织来源  36-37
    2.4.2 培养条件  37-38
    2.4.3 分离方法的选择  38
    2.4.4 纯化方法  38-39
    2.4.5 上皮细胞的传代  39
  2.5 小结  39-40
第三章 XO/X 与 H2O2损伤 IEC 模型的建立与 α-硫辛酸对 IEC 氧化损伤的干预作用  40-57
  3.1 试验材料  40-41
    3.1.1 主要试剂  40
    3.1.2 试验仪器  40-41
    3.1.3 材料制备  41
  3.2 试验方法  41-43
    3.2.1 LA 大鼠IEC 增殖的影响  41
    3.2.2 XO/X 与H_20_2 损伤IEC 模型的建立  41-42
    3.2.3 LA 对XO/X 与H_20_2 胁迫大鼠IEC 的干预作用  42-43
  3.3 结果与分析  43-53
    3.3.1 大鼠IEC 的形态学观察  43-44
    3.3.2 LA 对大鼠IEC 增殖的影响  44-45
    3.3.3 XO/X 与H_20_2 损伤IEC 模型的建立  45-46
    3.3.4 LA 对在XO/X 与H_20_2 氧化胁迫下对上皮细胞增殖的影响  46-47
    3.3.5 LA 对在XO/X 与H_20_2 氧化胁迫下IEC 的SOD 和GSH-Px 活性的影响  47-48
    3.3.6 LA 对在XO/X 与H_20_2 氧化胁迫下对培养液中MDA 含量的影响  48-49
    3.3.7 LA 对在XO/X 与H_20_2 氧化胁迫下对IEC 中脂肪酶和淀粉酶的影响  49-51
    3.3.8 LA 对在XO/X 与H_20_2 氧化胁迫下对LDH 的影响  51-52
    3.3.9 LA 对在XO/X 与H_20_2 氧化胁迫下DAO 的影响  52-53
  3.4 讨论  53-56
    3.4.1 LA 对XO/X 与H_20_2 氧化胁迫下IEC 抗氧化能力的影响  53-55
    3.4.2 LA 对XO/X 与H_20_2 氧化胁迫下IEC 功能酶的干预作用  55
    3.4.3 LA 对XO/X 与H_20_2 氧化胁迫下IEC 细胞结构功能完整性的干预作用  55-56
  3.5 小结  56-57
第四章结论  57-58
参考文献  58-66
附录  66-71
致谢  71-72
攻读学位期间发表的学术论文目录  72-74

氧自由基对大鼠小肠上皮细胞的损伤及硫辛酸的干预研究

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