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紫杉醇侧链合成基因侧翼序列克隆与生物信息学分析

作　者: 郭婧
导　师: 赵广荣
学　校: 天津大学
专　业: 生物分子工程
关键词: 红豆杉紫杉醇侧链生物合成热不对称交错PCR 密码子偏爱
分类号: S791.49
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

紫杉醇是从红豆杉属植物中提取的一种具有高效抗肿瘤活性的药物,因其独特的抗癌机理成为新一代抗癌药物的代表。但紫杉醇的化学合成方法效率低,天然提取紫杉醇的资源受限。生物合成紫杉醇成为一种有潜力的方法,但还有数个基因未克隆和鉴定。本文针对紫杉醇侧链生物合成的3个基因:氨基变位酶(PAM)、苯基丙酸-CoA转移酶(BAPT)、3-N-苯甲酰基转移酶(DBTNBT)的染色体分布,展开研究。通过同源克隆得到东北红豆杉侧链合成酶PAM、BAPT、DBTNBT的部分基因序列,利用热不对称交错PCR方法,分别向3个基因的上下游扩增侧翼序列,得到PAM及其上下游序列共4.5kb,BAPT及其上下游序列共6.6kb,DBTNBT及其上下游共4.3kb。生物信息学分析表明PAM基因含有2个外显子和1个内含子,ORF长1815bp,启动子长约353bp,终止子长约723bp;BAPT基因含有2个外显子和1个内含子,ORF长1333bp,启动子长约103bp,终止子长约245bp;DBTNBT基因含有2个外显子和1个内含子,ORF长1326bp,启动子长约455bp,终止子长约158bp。对紫杉醇合成途径中的46个基因的碱基组成分析,表明G/C含量较低(43.4%)。密码子偏爱性分析,发现紫杉醇生物合酶编码氨基酸Ala、Asp、Phe、Gly、His、Asn、Arg、Thr、Tyr的密码子具有明显的偏爱性,它们均偏爱使用含有A/T的密码子,同时出现频率较高的密码子也多含有A/T,这与紫杉醇合成基因A/T含量高是一致的。以上对紫杉醇侧链合成途径3个酶基因的初步认识和紫杉醇合成途径密码子偏爱性的初步研究,为以后深入研究紫杉醇侧链生物合成奠定了一定基础。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
前言  8-9
第一章文献综述  9-19
  1.1 紫杉醇侧链的生物合成  9-11
    1.1.1 侧链的基本合成途径  9-10
    1.1.2 氨基变位酶  10-11
    1.1.3 苯基丙酸-CoA转移酶  11
    1.1.4 3-N-苯甲酰基转移酶  11
    1.1.5 2’-羟化酶  11
  1.2 染色体步移技术  11-14
    1.2.1 反向PCR技术  12
    1.2.2 连接PCR技术  12
    1.2.3 特殊引物PCR技术  12-14
  1.3 基于染色体的基因结构生物信息学分析  14-17
    1.3.1 启动子分析  15
    1.3.2 内含子分析  15-16
    1.3.3 终止子分析  16
    1.3.4 蛋白质理化性质分析  16
    1.3.5 进化树分析  16
    1.3.6 偏爱密码子分析  16-17
  1.4 本文的研究意义和主要研究内容  17-19
    1.4.1 研究意义  17
    1.4.2 研究内容  17-19
第二章实验材料与方法  19-28
  2.1 材料  19-22
    2.1.1 红豆杉细胞、菌种、载体和引物  19-20
    2.1.2 主要仪器和试剂  20-22
  2.2 基本基因操作方法  22-25
    2.2.1 东北红豆杉基因组提取  22
    2.2.2 大肠杆菌感受态制备  22-23
    2.2.3 基因克隆的PCR反应  23
    2.2.4 琼脂糖凝胶电泳  23
    2.2.5 PCR产物纯化回收  23-24
    2.2.6 连接与转化  24
    2.2.7 菌落PCR验证  24-25
    2.2.8 质粒提取  25
    2.2.9 质粒酶切验证  25
  2.3 TAIL-PCR染色体步移技术  25-28
第三章紫杉醇侧链合成3 个基因及其侧翼序列的克隆  28-43
  3.1 PAM基因及其侧翼序列的克隆  28-32
    3.1.1 实验方法  28-29
    3.1.2 PAM基因及其侧翼序列扩增结果与分析  29-32
  3.2 BAPT基因及其侧翼序列的克隆  32-38
    3.2.1 实验方法  32-33
    3.2.2 BAPT基因及其侧翼序列扩增结果与分析  33-38
  3.3 DBTNBT基因及其侧翼序列的克隆  38-42
    3.3.1 实验方法  38-39
    3.3.2 DBTNBT基因及其侧翼序列扩增结果与分析  39-42
  3.4 本章小结  42-43
第四章紫杉醇生物合成基因序列分析  43-56
  4.1 材料与方法  43-44
    4.1.1 紫杉醇合成基因来源  43
    4.1.2 软件与数据库资源  43-44
    4.1.3 序列分析方法  44
  4.2 结果与讨论  44-55
    4.2.1 PAM基因分析  44-46
    4.2.2 BAPT基因结构分析  46-49
    4.2.3 DBTNBT基因结构分析  49-51
    4.2.4 紫杉醇生物合成基因偏爱密码子分析  51-55
  4.3 本章小结  55-56
第五章结论与展望  56-58
  5.1 结论  56
  5.2 展望  56-58
参考文献  58-62
附录  62-76
发表论文和参加科研情况说明  76-77
致谢  77

紫杉醇侧链合成基因侧翼序列克隆与生物信息学分析

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