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外源性TGF-β1对绒癌JEG-3细胞增殖与侵袭的影响及分子机制研究

作　者: 李晓茹
导　师: 李玉红
学　校: 承德医学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 外源性TGF-β1 绒毛膜癌JEG-3细胞细胞增殖侵袭 Smad3mRNA Smad7mRNA MMP-9蛋白及mRNA TIMP-1蛋白及mRNA
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

转化生长因子-β(TGF-β)超家族是由许多具有共同生物学特性的细胞因子所组成的大家族,目前发现TGF-β至少有六个结构相关的分子(TGF-β1-6),但在哺乳动物中只发现3个亚型:TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β来源广泛,它在多种正常及转化细胞中都有表达,如活化T细胞、巨噬细胞、胎盘滋养细胞等。作为参与体内生理生化、信号转导与调控的重要因子,TGF-β在调控胚胎的发育、细胞的分化与增殖、免疫反应及细胞外基质的合成等方面起着重要的作用,而且与肿瘤的发生发展密切相关。绒毛膜癌简称绒癌,是一种来源于胎盘滋养细胞的肿瘤,恶性度高,和其他恶性肿瘤一样,滋养细胞的异常增殖和高度侵袭导致了绒癌的发生与发展。目前TGF-β/Smads信号介导的细胞增殖和侵袭作用越来越受到关注,Smads作为此转导通路的重要因子,可将信号由细胞外转导至细胞内,从而使TGF-β发挥正常的生物学作用,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是降解细胞外基质(ECM)的一组重要的蛋白水解酶类,基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs)是一组能特异性抑制MMPs活性的内源性低分子量蛋白质,MMPs/TIMPs参与了肿瘤细胞的浸润和转移。有关于TGF-β、Smads及MMPs/TIMPs在绒癌中的研究报道罕见,因此我们观察TGF-β1对绒癌JEG-3细胞增殖和侵袭的影响,同时检测Smad3,7及MMP-9、TIMP-1的表达情况,将会为绒癌发病机制和临床防治研究提供更为有力的理论依据。第一部分外源性TGF-β1对绒癌JEG-3细胞体外增殖的影响及意义目的:以外源性TGF-β1预处理绒癌JEG-3细胞,采用MTT比色法检测JEG-3细胞的增殖活力,以便观察TGF-β1对JEG-3细胞增殖活力的影响及意义。方法:本文的研究对象为永生化的绒癌JEG-3细胞系。选取处于对数生长期的JEG-3细胞,用终浓度为0.25%胰酶和0.02%EDTA混合液消化细胞为单细胞悬液:调整细胞初始浓度为3×104/mL(200μL/孔),培养48h后饥饿同步化24小时。加入人重组TGF-β1,使其终浓度分别为0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL,共作用48h;同时,用100ng/mL TGF-β1诱导JEG-3细胞,分别培养0h、12h、24h和48h。同时设立零对照组及空白对照组,每组设5个平行孔,采用MTT比色法检测各组细胞的增殖活力。结果:(1)随着TGF-β1浓度的增大,各组JEG-3细胞的增殖活力明显增强(P<0.05)。(2)随着TGF-β1作用时间的延长,各组JEG-3细胞的增值活力明显增强(P<0.05)。结论:外源性的TGF-β1可促进绒癌JEG-3细胞的增殖,并呈良好的浓度和时间依赖性。第二部分外源性TGF-β1对绒癌JEG-3细胞表达Smad3,7mRNA的影响目的:以不同应用浓度和作用时间的TGF-β1处理绒癌JEG-3细胞,采用RT-PCR技术检测JEG-3细胞Smad3mRNA及Smad7mRNA的表达情况,以期探讨TGF-β1促进JEG-3细胞增殖的分子机制。方法:以1×105/mL的细胞浓度将JEG-3细胞接种于六孔板,培养48小时,饥饿同步化24小时。TGF-β1实验分组:浓度组:0ng/mL、100ng/mL和200ng/mL,48h收获细胞;时间组:用100ng/mL的TGF-β1处理细胞,取时间分别为作用后0h、12h、24h和48h,终止培养。每组设5个平行孔。提取细胞总RNA,采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription PolymeraseChain Reaction,RT-PCR)检测各组Smad3mRNA,Smad7mRNA的表达情况。结果:(1)与不同浓度TGF-β1共温育48h后,随着TGF-β1应用浓度的增大,各组JEG-3细胞中Smad3mRNA的含量逐渐升高(P<0.05);而各组Smad7mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。(2) 100ng/mLTGF-β1与绒癌JEG-3细胞共温育后,随着作用时间的延长,各组细胞中Smad3mRNA的表达显著增加(P<0.05);而各组Smad7mRNA表达无差异(P>0.05)。结论:绒癌JEG-3细胞不存在Smad3mRNA及Smad7mRNA表达的缺失,在一定的工作浓度和作用时间内,TGF-β1可促进绒癌JEG-3细胞表达Smad3mRNA,具有良好的浓度和时间依赖性;而Smad7mRNA对此无应答。第三部分TGF-β1对绒癌JEG-3细胞MMP-9,TIMP-1蛋白及mRNA表达的影响目的:以外源性的TGF-β1预处理绒癌JEG-3细胞,进而检测JEG-3细胞MMP-9,TIMP-1蛋白及mRNA的表达情况,以求揭示JEG-3细胞浸润转移的分子机制。方法:以1×105/mL的细胞浓度将JEG-3细胞接种到6孔板,细胞贴壁48h,饥饿同步化24小时,加入不同浓度的人重组TGF-β1,即终浓度分别为0ng/mL、100ng/mL和200ng/mL,共温育48h后终止培养。同时观察TGF-β1的不同处理时间对细胞的影响,用100ng/mL TGF-β1处理JEG-3细胞,分别在孵育0h、12h、24h、、48h和72h,终止培养。每组设5个平行孔。提取细胞总蛋白和细胞总RNA,采用蛋白印迹法(Western Blotting)和RT-PCR检测各组MMP-9,TIMP-1蛋白及MMP-9mRNA,TIMP-1mRNA表达情况。结果:(1)以TGF-β1作用于绒癌JEG-3细胞48h后,随着TGF-β1应用浓度的增大,各组MMP-9,TIMP-1蛋白及mRNA含量均呈现出显著增加的趋势(P<0.05)。(2)以100ng/mL TGF-β1作用于绒癌JEG-3细胞,随着TGF-β1作用时间的延长,JEG-3细胞MMP-9,TIMP-1蛋白及mRNA表达量逐渐增加(P<0.05)。(3)各浓度组和时间组MMP-9/TIMP-1及MMP-9mRNA/TIMP-1mRNA均大于1,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:绒癌JEG-3细胞可表达MMP-9及TIMP-1,且其对外源性的TGF-β1有良好的反应性,随着TGF-β1工作浓度的增大和作用时间的延长,JEG-3细胞中MMP-9,TIMP-1蛋白及MMP-9mRNA,TIMP-1mRNA的表达逐渐增加,表现为良好的浓度和时间依赖性。不同应用浓度和作用时间下,MMP-9/TIMP-1及MMP-9mRNA/TIMP-1mRNA比值均大于1,TIMP-1相对减少,使得MMP-9活性增强,导致绒癌JEG-3细胞向远处浸润转移。

全文目录

中文摘要  6-10
英文摘要  10-14
英文缩写  14-15
研究论文外源性TGF-β1 对绒癌JEG-3 细胞增殖与侵袭的影响及分子机制研究  15
引言  15-16
第一部分外源性 TGF-β1 促进绒癌 JEG-3 细胞体外增殖的研究及意义  16-27
  前言  16
  材料与方法  16-18
  结果  18-20
  附图  20-21
  附表  21-22
  讨论  22-23
  小结  23-25
  参考文献  25-27
第二部分外源性 TGF-β1 对绒癌 JEG-3 细胞表达 Smad3,7m RNA 的影响  27-42
  前言  27
  材料与方法  27-30
  结果  30-31
  附图  31-35
  附表  35-37
  讨论  37-39
  小结  39-40
  参考文献  40-42
第三部分 TGF-β1 对绒癌JEG-3 细胞MMP-9,TIMP-1 蛋白及表达的影响  42-70
  前言  42
  材料与方法  42-45
  结果  45-48
  附图  48-58
  附表  58-64
  讨论  64-66
  小结  66-68
  参考文献  68-70
结论  70-71
综述  71-77
  参考文献  75-77
致谢  77-78
个人简历  78

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