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非增殖性腺病毒携带全长抗体Cetuximab的肿瘤基因治疗的研究

作　者: 刘海平
导　师: 钱其军
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 基因治疗腺病毒腺相关病毒 Cetuximab HER1
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

单克隆抗体以特异性高、性质均一和针对特定靶点定向制备等诸多优点而广泛应用于各种疾病的治疗,特别是在肿瘤领域内的应用备受关注,美国FDA先后批准了10多个用于治疗肿瘤的抗体药物,都是全长抗体。虽然单克隆抗体在肿瘤治疗中发挥了重要的作用,但全长单克隆抗体治疗肿瘤出现的主要问题涉及价格方面:治疗肿瘤的抗体需要量极多且纯度要求高,目前的生物制药工艺难以满足市场的需求,大规模、高密度的哺乳动物细胞培养技术是目前国际上的一大难题,这些均导致高生产成本及昂贵的价格,一般患者难以承受。因此,本课题的目的是利用非增殖腺病毒作为载体携带全长抗体基因在体内表达全长抗体,这样可以避免在体外用哺乳动物细胞表达抗体,以及纯化等复杂而且昂贵的规程。我们选择对肿瘤有明显疗效的ImClone Systems公司开发的抗EGFR单克隆抗体Cetuximab(C225)作为目的基因。由于EGFR在很多肿瘤中都有过量表达,在肿瘤的发生、生长、抗药性和转移性中都起到了重要的作用,Cetuximab对过量表达EGFR的肿瘤有良好的治疗作用,现已被批准用于头颈癌、直肠癌和肺癌的治疗,无论是单独使用还是与其它药物联合应用都有很好的效果,只有很小的副作用。Cetuximab单抗应用其它肿瘤治疗的研究也在大力的开发中,在肿瘤的治疗中有很大应用前景,但是由于其生产成本过高,国内普通患者难以承担,而抗体基因治疗正好解决了这个问题。方法与结果我们首先合成Cetuximab抗体基因的轻链及重链,且在轻链及重链前面各自合成抗体的信号肽基因,用IRES元件连接抗体的轻链和重链基因,以实现Cetuximab抗体的重链和轻链的平衡性及完整性。本课题的另外一个创意就是利用密码子的偏爱性修改部分抗体基因密码子,来提高抗体在体内外的表达,平衡重轻链的表达从而减少其毒性。本课题还把腺相关病毒两边提供复制信号的ITR序列装入到腺病毒载体中获得杂交病毒,杂交病毒在体内部分的复制能力,能有效提高抗体的表达量和延长表达时间。1、表达全长抗体Cetuximab(C225)的腺病毒载体Ad5-C225、Ad339-NC225和Ad5-UDITR-NC225的构建及制备:(1)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成的Cetuximab抗体的全长基因和新的改变过密码子后的Cetuximab抗体的全长基因,并分别在轻链和重链基因的前端加上分泌型信号肽。(2)以上抗体Cetuximab基因分别插入到腺病毒载体pDC339和pDC311-ITR中,得到腺病毒穿梭载体pDC339-C225和pDC339-NC225,pDC311-ITR-NC225与骨架载体pBHGE3共转染293细胞,10天后出现病毒空斑,经过逐步病毒空斑纯化,PCR鉴定正确的腺病毒分别命名为Ad5-C225,Ad5-NC225, Ad5- ITR-NC225。经293细胞扩增、HPLC法纯化、qRT-PCR(实时荧光定量PCR)的方法测重组腺病毒滴度和TCID50测得病毒滴度。2、表达全长抗体Cetuximab的腺病毒载体Ad5-Her Ad5-NC225, Ad5- ITR-NC225的体外实验:1) Ad-C225、Ad339-NC225、Ad5-UDITR-NC225感染293细胞,ELISA测定感染72小时后Cetuximab表达量分别为(25.2±3)ng/ml、317.6±5ng/ml和425.9±5ng/ml;但是它们在LO2细胞中基本不表达抗体。2)抗体的生物学活性检测:间接免疫荧光实验显示Ad-C225、Ad339-NC225、Ad5-UDITR-NC225在293细胞中表达的抗体与HER1抗原有很好的特异性结合能力,与商品化抗体Cetuximab相似;Western Blot实验显示3个重组腺病毒载体表达的抗体轻链和重链与商品化Cetuximab的轻、重链相近,且轻链和重链的平衡性也比较好,说明表达的抗体可以形成完整的全长抗体。结论:本课题已经成功构建了3个能表达有活性的全长单克隆抗体的重组腺病毒载体,并测定它们在体外的表达差异和检验表达的抗体的生物学性质。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-14
缩略词表  14-15
第一章前言  15-20
  1.1 EGFR 的信号通路及单克隆抗体的作用  15-19
    1.1.1 EGFR 蛋白及其信号通路  15-16
    1.1.2 EGFR 的靶点药物和它们的作用机理  16-18
    1.1.3 全长单克隆抗体Cetuximab  18-19
  1.2 本课题的创意及构想  19-20
第二章通过修改 Cetuximab 抗体密码子和改进腺病毒载体来提高其表达量  20-58
  2.1 前言  20
  2.2 材料  20-27
    2.2.1 主要质粒和载体  20-21
    2.2.2 主要试剂及试剂盒  21-22
    2.2.3 主要仪器  22
    2.2.4 细胞株  22-23
    2.2.5 引物合成  23
    2.2.6 基因的合成  23-27
  2.3 载体的构建示意图  27-29
    2.3.1 pDC-339-C225 的构建示意图  27-28
    2.3.2 pDC-339-NC225 的构建示意图  28
    2.3.3 pDC311-UDITR-NC225 的构建示意图  28-29
  2.4 构建步骤及方法  29-43
    2.4.1 腺病毒穿梭载体pDC339-C225 的构建  29-35
    2.4.2 腺病毒穿梭载体pDC339-NC225 的构建  35-40
    2.4.3 腺病毒穿梭载体pDC311-UDITR-NC225 的构建  40-43
  2.5 腺病毒Ad5-C225、Ad5-NC225、Ad5-UDITR-NC225 的重组及扩增  43-47
    2.5.1 293 细胞培养  43
    2.5.2 腺病毒重组及其鉴定  43-44
    2.5.3 病毒的扩增  44-45
    2.5.4 用qRT-PCR(实时荧光定量PCR)的方法测重组腺病毒滴度  45
    2.5.5 HPLC 纯化病毒  45-46
    2.5.6 应用5096组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度  46-47
  2.6 结果  47-55
    2.6.1 腺病毒穿梭载体pDC339-C225 的构建  47-50
    2.6.2 腺病毒穿梭载体pDC339-NC225 的构建  50-52
    2.6.3 腺病毒穿梭载体pDC311-UDITR-NC225 的构建  52-53
    2.6.4 腺病毒Ad5-C225、Ad5-NC225、Ad5-UDITR-NC225 的野毒PCR 法鉴定和全长抗体基因的PCR 法鉴定  53-54
    2.6.5 三个病毒滴度的测定  54-55
  2.7 讨论  55-58
第三章表达全长抗体Cetuximab 的腺病毒载体的体外实验  58-70
  3.1 前言  58
  3.2 材料  58-62
    3.2.1 实验细胞株  58
    3.2.2 主要试剂  58-59
    3.2.3 主要仪器设备列表  59-60
    3.2.4 主要溶液的配制  60-62
  3.3 方法  62-66
    3.3.1 三个重组腺病毒载体在细胞中Cetuximab 抗体的表达量测定  62-63
    3.3.2 Western Blot 方法检测抗体Cetuximab 的表达  63-65
    3.3.3 病毒表达的Cetuximab 抗体特异性测定：间接免疫荧光实验(IFA)  65-66
  3.4 结果  66-68
    3.4.1 ELISA 检测  66
    3.4.2 Western Blot 检测  66
    3.4.3 重组病毒表达的Cetuximab 抗体特异性测定  66-68
  3.5 讨论  68-70
结论  70-71
参考文献  71-75
致谢  75

非增殖性腺病毒携带全长抗体Cetuximab的肿瘤基因治疗的研究

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