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动物可食组织中安眠酮残留的ELISA检测方法研究

作　者: 崔翔
导　师: 邓干臻
学　校: 华中农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 安眠酮完全抗原间接竞争ELISA 提取
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

安眠酮(methaqualone,MTQ)为喹唑酮类衍生物,属于非巴比妥类中枢神经镇定药。在临床上常做为镇静、催眠药物,也用于麻醉前给药。长期服用此药会产生依赖性或成瘾性,因此安眠酮成为世界各国的管制类精神药物。但是由于安眠酮生产工艺比较简单,不法分子转入地下大量生产安眠酮,大肆用于畜禽养殖。因此,必须控制安眠酮在动物性食品中的残留,保障消费者健康与安全。本文完成了安眠酮完全抗原的制备及鉴定,建立了用于快速检测动物可食组织中安眠酮的间接竞争ELISA法,并且优化了安眠酮在动物可食组织中的提取、纯化方法。本试验用采用活泼酯法将延伸出羧基的半抗原安眠酮与载体牛血清白蛋白(BSA)及卵清白蛋白(OVA)偶联制备人工完全抗原。采用紫外扫描光谱和SDS-PAGE电泳、红外扫描光谱以及间接ELISA试验均表明偶联成功。用间接非竞争ELISA法优化ELISA工作条件,建立了间接竞争ELISA检测MTQ在动物可食组织中残留检测的方法。方阵滴定法确定了MTQ包被抗原的浓度为1.25ug/mL,多抗MTQ阳性血清的工作浓度为1：64000,酶标二抗(兔抗羊IgG-HRP)工作浓度为1：5000。以系列稀释的MTQ标准溶液作为添加样品,绘制标准曲线,得到的线性回归直线方程为y=-0.2373x+0.5639,相关系数,r2=0.993,标准曲线在0.15～37.97 ng/ml之间呈较好线性关系,最低检测限0.18ng/ml。在组织提取部分,动物组织中安眠酮添加的平均回收率为86.29%,说明该方法动物组织中安眠酮能够较好地被回收。计算不同浓度的MTQ与抗血清进行竞争反应时的抑制率,对同一批次的检测结果进行分析,得到的标准竞争抑制曲线的批内平均变异系数为在2.21%-12.05%范围内,对不同批次的检测结果进行分析,得到的标准竞争抑制曲线的批间平均变异系数在5.24%～10.93%范围内,也表明本研究方法重复性较好。在可测定浓度范围内,安眠酮(MTQ)抗血清与地西泮可能会因同时使用而导致共同残留,该试验与其交叉反应率小于0.01%,这表明所建立的方法有较高特异性和选择性,适合安眠酮残留样本快速检测。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-10
缩略语  10-11
第1章文献综述  11-21
  1. 安眠酮简介  11-18
    1.1 安眠酮药物概况  11-12
    1.2 安眠酮残留现状  12-13
    1.3 安眠酮检测方法现状  13-16
      1.3.1 薄层分析法(TLC)  13
      1.3.2 放射免疫法(RIA)  13-14
      1.3.3 色谱法  14-15
      1.3.4 高效毛细管电泳分析法(HPCE)  15-16
      1.3.5 其他  16
    1.4 各种检测方法的比较  16-17
    1.5 免疫分析在残留检测中的应用  17-18
  2 药物半抗原酶联免疫分析方法  18-20
    2.1 半抗原与完全抗原  18
    2.2 完全抗原的合成  18-20
      2.2.1 偶联方式的选择  19
      2.2.2 完全抗原鉴定  19-20
  3 实验的目的与意义  20-21
第2章安眠酮完全抗原的研制  21-36
  1 材料与方法  21-28
    1.1 材料  21-24
      1.1.1 主要试剂  21
      1.1.2 主要仪器  21-22
      1.1.3 主要溶液配方  22-24
    1.2 方法  24-28
      1.2.1 羧基延伸物的合成  24-25
      1.2.2 活性酷法合成安眠酮完全抗原  25-26
      1.2.3 半抗原偶联物的鉴定  26-28
  2. 结果与分析  28-35
    2.1 羧基延伸物的鉴定  28-30
      2.1.1 酮基处羧基延伸物的结果及分析  28-29
      2.1.2 化学方法合成的羧基衍生物结果及分析  29-30
    2.2 合成的安眠酮包被原的检测  30-34
      2.2.1 合成的安眠酮完抗原的紫外光谱分析  30-31
      2.2.2 SDS-PAGE凝胶检测结果及分析  31-32
      2.2.3 红外IR鉴定  32-33
      2.2.4 间接ELISA检测  33-34
    2.3 合成安眠酮免疫原的检测  34-35
      2.3.1 紫外光谱分析  34
      2.3.2 SDS-PAGE凝胶检测结果及分析  34-35
  3. 小结  35-36
第3章安眠酮多克隆抗体的制备  36-43
  1 材料与方法  36-39
    1.1 材料  36-37
      1.1.1 主要试剂  36
      1.1.2 主要仪器  36
      1.1.3 实验动物  36
      1.1.4 缓冲液体系  36-37
    1.2 方法  37-39
      1.2.1 动物免疫  37
      1.2.2 抗体纯化  37-38
      1.2.3 抗原抗体最佳工作浓度的确定  38-39
      1.2.4 抗体特异性试验  39
  2 结果与分析  39-42
    2.1 抗原和抗体的最佳工作浓度  39-40
    2.2 效价测定  40-41
    2.3 抗体特异性结果  41-42
  3 小结  42-43
第4章间接竞争ELISA方法的建立与优化  43-57
  1 材料与方法  43-48
    1.1 材料  43-44
      1.1.1 主要试剂  43
      1.1.2 主要仪器  43
      1.1.3 缓冲液体系  43-44
    1.2 方法  44-48
      1.2.1 ELISA基本操作步骤  44-45
      1.2.2 酶标板均一性的检测  45
      1.2.3 ELISA标准方法的建立  45-47
      1.2.4 标准曲线的建立  47
      1.2.5 交叉反应率的测定  47
      1.2.6 样品加标  47-48
  2. 结果与分析  48-55
    2.1 酶标板均一性的检测  48-49
    2.2 标准ELISA方法的建立  49-52
      2.2.1 间接ELISA条件的优化  49-51
      2.2.2 间接竞争ELISA标准方法的建立  51-52
    2.3 标准曲线的建立  52-53
    2.4 交叉反应结果  53
    2.5 样品添标结果  53-55
      2.5.1 回收率结果  53-54
      2.5.2 变异系数  54-55
  3 小结  55-57
第5章讨论  57-62
  1. 安眠酮完全抗原的合成  57-59
    1.1 羧基衍生物的合成  57-58
    1.2 安眠酮抗原偶联方法的选择  58
    1.3 载体蛋白的选择  58-59
    1.4 关于MTQ人工抗原的鉴定方法  59
    1.5 免疫抗原对抗血清的影响  59
  2. 间接竞争ELISA方法的建立与优化  59-62
    2.1 方法的检测限和精密度  59-60
    2.2 ELISA方法的交叉反应性  60
    2.3 安眠酮在动物可食组织中的提取  60-62
参考文献  62-67
致谢  67

动物可食组织中安眠酮残留的ELISA检测方法研究

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