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萝卜肉质根形成性状的蛋白组分析与种质资源鉴定

作　者: 朱长志
导　师: 柳李旺
学　校: 南京农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 萝卜肉质根膨大蛋白质提取 2-DE 种子蛋白
分类号: S631.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

萝卜(Raphanus sativus L.)十字花科、萝卜属；原产于中国重要的世界性蔬菜作物。肉质根为萝卜的主要产品器官,它发育的好坏直接影响到萝卜的品质和产量。对萝卜肉质根形成的研究,曾长期处于形态描述和生理生化研究阶段；而在蛋白质水平上,对其形成膨大机理进行蛋白组学的研究还是空白。因此本研究主要从萝卜肉质根总蛋白质提取和双向电泳染色方法等方面建立适合萝卜蛋白质组学研究技术体系,并对肉质根形成膨大过程中蛋白质的变化进行初步分析,以期为从蛋白质分子水平上揭示肉质根形成膨大机理提供一定的参考,以及为萝卜的品质与产量等其他重要园艺学性状的遗传改良提供技术和理论依据。主要研究结果如下：采用了三氯乙酸-丙酮沉淀法,酚抽提法,三氯乙酸-丙酮-酚提取法三种方法提取肉质根总蛋白质,对其进行纯蛋白质产量、SDS-PAGE.双向电泳分析。实验结果表明：三氯乙酸-丙酮提取法提取的总蛋白质中杂质含量高,蛋白质种类少,不适合萝卜肉质根蛋白质的提取；酚提取法和三氯乙酸-丙酮-酚提取法在提取的蛋白质纯度、SDS-PAGE条带数、双向电泳图谱蛋白质点数目、横向及纵向条纹等方面均有较好的效果,均适合萝卜肉质根总蛋白质的提取,其中酚提取法更适合白皮杂质少萝卜品种总蛋白质提取,三氯乙酸-丙酮-酚提取法更适合红皮杂质含量高的萝卜品种。通过染色的灵敏度、背景色、横向和纵向条纹、假点、实验操作性、时间以及与质谱的兼容性等方面综合比较了经典考马斯亮蓝染色(CBB-R250)、胶体考马斯亮蓝染色(CBB-G250)和硝酸银染色(银染)三种蛋白质检测方法。结果表明：银染的灵敏度最高,但操作不易控制,且容易产生横向和纵向条纹;CBB-R250与CBB-G250的灵敏度较银染低,但操作上CBB-R250更简单,费用低、重复性好、与质谱兼容。因此,在蛋白质组学研究中,可先通过银染对蛋白质样品进行差异分析,找出差异显示的蛋白质点,再通过CBB-R250进行定量分析和质谱鉴定。以高根冠比’NAU-XXXS’和低根冠比’NAU-LLYH’为材料,采用三氯乙酸-丙酮-酚提取法分别提取破肚期、叶片生长期、膨大盛期萝卜肉质根总蛋白质,进行双向电泳分离,通过图像分析软件PD Quest 8.0对电泳图谱进行定量分析。结果表明,两个供试材料,在肉质根发育不同时期蛋白质表达均有变化。在高根冠比’NAU-XXXS’共检测出差异的蛋白质点数目为16个,其中有5个蛋白质点从破肚期开始表现为下调、5个蛋白质点表现为上调、2个蛋白质点仅在肉质根膨大盛期才表达、4个蛋白质点先上调后又下调。在低根冠比中’NAU-LLYH’共检测出差异表达的蛋白质点数为18个,其中7个蛋白质点表现为上调,3个蛋白质点表现为下调,5个蛋白质点表现为先上调后又下降、3个蛋白质点在肉质根破肚期和膨大期均有较高的表达量。并选取10个蛋白质点进行了质谱分析,鉴定出转运蛋白和伸长因子等多个蛋白质。这些蛋白质点的差异表达可能与萝卜肉质根形成膨大存在一定的相关性。运用SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)技术,对32个抗热萝卜材料种子蛋白的遗传多态性进行研究,共检测出41条蛋白谱带,多态性谱带25条(61%)；每个材料可检测出28-39条谱带,所有材料蛋白谱带均有差异,可进行品种鉴别；供试材料蛋白谱带相似系数为0.64-0.98,平均为0.79；聚类分析表明,在相似系数0.76处所有种质可分为白皮与红皮两大类。研究显示基于种子蛋白谱带的聚类结果与肉质根皮色有较高的相关性,抗热萝卜材料遗传多样性较低,遗传基础比较狭窄。

全文目录

摘要 7-9ABSTRACT 9-11缩略词表 11-12引言 12-14第一章文献综述 14-26 1 萝卜肉质根发育的研究进展 14-17 1.1 肉质根发育的形态解剖学研究 14 1.2 肉质根发育过程中的环境因素 14-15 1.3 肉质根发育过程中的生理生化机制研究 15-16 1.4 肉质根发育过程中相关特异蛋白研究 16-17 2 蛋白质组学研究背景与进展 17-19 2.1 蛋白质组学的研究背景 17-18 2.2 蛋白质组学的概念 18 2.3 蛋白质组学的研究进展 18-19 2.4 蔬菜作物中蛋白质组学研究 19 3 蛋白质组学研究方法与技术 19-24 3.1 样品的制备 19-20 3.2 样品的分离——双向电泳(two-dimensional electrophresis 2-DE) 20-22 3.2.1 等电聚焦(isoelectric focusing IEF) 20-21 3.2.2 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 21 3.2.3 蛋白质的染色技术 21-22 3.3 图像分析技术 22 3.4 蛋白质质谱分析技术 22-23 3.5 蛋白质数据库 23-24 4 本研究的日的及意义 24-26第二章萝卜肉质根蛋白质高效提取方法研究 26-34 1 材料和方法 27-29 1.1 材料 27 1.2 方法 27-28 1.2.1 三氯乙酸-丙酮沉淀法提取总蛋白质 27 1.2.2 酚抽提法提取总蛋白质 27 1.2.3 三氯乙酸-丙酮-酚抽提法提取总蛋白质 27-28 1.3 蛋白质的溶解与定量 28 1.4 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 28 1.5 双向电泳 28 1.6 图像采集与分析 28-29 2 结果与分析 29-31 2.1 蛋白质产量与纯度比较 29 2.2 SDS-PAGE图谱比较 29-30 2.3 双向电泳图谱比较 30-31 3 讨论 31-34第三章双向电泳三种染色方法比较分析 34-40 1 材料与方法 35-36 1.1 材料 35 1.2 总蛋白质的提取 35 1.3 蛋白质溶解与定量 35 1.4 双向电泳分析 35-36 1.4.1 等电聚焦(IEF) 35 1.4.2 胶条的平衡 35-36 1.4.3 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳分析(SDS-PAGE) 36 1.5 染色 36 1.5.1 银染 36 1.5.2 考马斯亮蓝R-250染色(CBB-R250) 36 1.5.3 胶体考马斯亮蓝染色(CBB-G250) 36 1.6 双向电泳图谱采集与分析 36 2 结果与分析 36-38 2.1 经典考马斯亮蓝染色与胶体考马斯亮蓝染色分析 36-37 2.2 经典考马斯亮蓝染色与银染分析 37-38 3 讨论 38-40第四章萝卜肉质根不同发育时期的双向电泳分析 40-52 1 材料与方法 41-42 1.1 材料 41 1.2 萝卜肉质根总蛋白质的提取 41 1.3 蛋白质的溶解与定量 41 1.4 第一向等电聚焦(IEF) 41-42 1.5 第二向SDS-PAGE电泳 42 1.6 考马斯亮蓝染色 42 1.7 图像采集与分析 42 1.8 蛋白质点胶内酶解与质谱分析 42 1.9 数据库检索与分析 42 2 结果与分析 42-51 2.1 NAU-XXXS肉质根不同发育时期双向电泳图谱分析 42-45 2.2 NAU-LLYH肉质根不同发育时期双向电泳图谱分析 45-48 2.3 NAU-XXXS与NAU-LLYH蛋白质双向电泳图谱比较分析 48-49 2.4 质谱鉴定的蛋自质点分析 49-51 3 讨论 51-52第五章利用种子蛋自SDS-PAGE技术进行抗热萝卜种质鉴定 52-58 1 材料和方法 53-54 1.1 材料 53 1.2 方法 53-54 1.2.1 种子贮藏蛋白提取 53 1.2.2 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 53-54 1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶染色 54 1.2.4 数据分析 54 2 结果与分析 54-57 2.1 两种染色方法比较 54-55 2.2 供试材料种子蛋白电泳分析 55-56 2.3 SDS-PAGE电泳图谱聚类分析 56-57 2.4 材料亲缘关系分析 57 3 讨论 57-58全文结论 58-59参考文献 59-66附录 66-68硕士在读期间发表论文情况 68-69致谢 69

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