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铁结合蛋白及其突变体的表达、纯化、结构和功能研究

作　者: 陈维敬
导　师: 仲维清
学　校: 第二军医大学
专　业: 无机化学
关键词: 铁结合蛋白突变体Y195F 焦磷酸盐酶促水解反应晶体核磁共振 westen-blotting X-射线单晶衍射
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

铁是生物体必需的微量元素,然而,在人类和其他哺乳动物中,由于在血液pH值条件下Fe³⁺会形成沉淀及产生氧化性损伤,血液中的Fe³⁺被严格调控在10^-18mol·L^-1。为维持生长、繁殖,细菌进化出高效的从宿主体内获取铁的体系。铁结合蛋白（ferric-ion binding protein,FBP）是这类系统之一,是一些致病菌如奈瑟氏淋病双球菌（Neisseria gonorrhoeae）、奈瑟氏脑膜炎双球菌（Neisseria meningitidis）等细菌周质中的一种高度保守的铁运载蛋白,与细菌的生长,繁殖和致病能力密切相关。奈瑟氏菌属的铁结合蛋白为一水溶性单链蛋白质,由309个氨基酸残基构成,分子量约34kDa,其晶体结构显示,多肽链构成两个结构域,用一个组氨酸（His9）、一个谷氨酸（Glu57）和2个酪氨酸（Tyr195与Tyr196）残基与Fe³⁺配位,另有一个水分子和一个磷酸根离子作为配阴离子。铁结合蛋白与Fe³⁺的结合为可逆性的,Fe³⁺能从含铁铁结合蛋白（holo-FBP）上脱去成为脱铁铁结合蛋白（apo-FBP）。一些其它金属离子也可占据FBP中Fe³⁺的结合位点,因此其Fe³⁺的结合位点,可能是一些具有抗菌作用或抗癌活性的金属离子的潜在靶点。蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,它参与和调控生物体内的许多生命活动。通过蛋白激酶作用下的磷酸化和磷酸（酯）酶的作用下的去磷酸化,调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程。已有文献报道,铁结合蛋白除了具有运载Fe³⁺的功能外,还有磷酸酯酶的活性,然而,其反应机理未见报道,也没有发现apo-FBP的磷酸酯酶活性。本文首次报道了apo-FBP具有催化焦磷酸键（PPi）水解的酶学功能。利用31P NMR、V-Vis、Western blotting试验、ICP-AES等技术,测定了apo-FBP催化PPi水解的动力学常数:在10mmol·L^-1 pH7.4 Hepes缓冲液中,293K温度下,该酶促反应为零级反应。反应速率与PPi的浓度无关但依赖于酶的浓度。当[apo-FBP]为36、86、107、217μmol·L^-1时,测得反应速率常数分别为1.02×10^-2、1.04×10^-2、0.10、0.135mmol·L^-1·h^-1。反应速率还与pH呈正相关,在相同条件下,[apo-FBP]为75μmol·L^-1、[PPi]:[FBP] = 50:1时,测得pH值为8.5时的反应速率是pH值为7.4时的1.2倍,pH值为7.4时的反应速率是pH值为6.5时的1.18倍。而微量Fe³⁺对反应有进一步的催化作用,加入2%Fe³⁺,反应速率增加到1.6倍。而holo-FBP催化PPi水解反应的反应速率是相同条件下apo-FBP的2.6倍。本文表达、纯化了FBP突变体Y195F,发现其不含Fe³⁺,且结合Fe³⁺的能力比原型FBP弱的多,形成三元复合物Y195F-Fe-（NTA）x的表观结合常数为1.4×10³L·mol^-1(10mmol·L^-1 pH7.4 Hepes缓冲液,298K),而Y195F催化PPi水解的反应速率仅是相同条件下apo-FBP的1/10([Y195F] = 79μmol·L^-1,[PPi]:[Y195F] = 50:1)。Western blotting试验、ICP-AES结果显示,apo-FBP不含铁和磷酸根,也没有酪氨酸磷酸化现象,而holo-FBP、apo-FBP与PPi的反应产物及holo-FBP与PPi的反应产物都有酪氨酸磷酸化现象,每分子蛋白分别约含有1个、2个和1个Pi。根据以上实验结果,我们提出了apo-FBP催化PPi水解的机理是通过蛋白质的酪氨酸磷酸化过程进行的。而holo-FBP首先被PPi脱去Fe³⁺转变为apo-FBP,再通过酪氨酸磷酸化过程催化PPi的酶促水解反应。磷酸化的位点就是Fe³⁺的结合位点Y195（Y196是否是磷酸化位点有待进一步证实）。本文还制备了谷氨酸铜与apo-FBP的重组体,探索了培养晶体的条件,并用X-射线单晶衍射对重组体的晶体结构进行了初步分析。在质量分数为20%～21% PEG4000,pH7.6～7.8,蛋白浓度为1～1.8mg/ml,温度290K的条件下,可以得到大小合适,外观规整的晶体,晶体的空间群为C222,每个晶胞含有9个蛋白分子,a = 130.985A,b = 162.650A,c = 385.525?,α=β=γ= 90°。本文研究发现,细菌的铁运载蛋白FBP具有催化焦磷酸键水解,即磷酸酯酶的活性,而其作用的机理是通过铁的关键结合位点酪氨酸的磷酸化来进行的,这在细菌的能量供应方面可能具有重要的意义。同时,Cu（Glu）2-FBP的研究,也为基于FBP作为靶分子的抗菌药物的设计提供了有益探索。

铁结合蛋白及其突变体的表达、纯化、结构和功能研究

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