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一种与聚羟基脂肪酸酯生物合成相关的新型水合酶结构生物学研究

作　者: 王会征
导　师: 张修国
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水合酶 聚羟基脂肪酸酯 晶体 结构 突变 酶活
分类号: S436.418
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


辣椒疫霉是一种世界性土传病害，辣椒疫病严重影响世界各国的辣椒生产，造成了巨大的经济损失。该病寄主范围广，可以侵染辣椒、西葫芦、黄瓜、茄子、番茄等20多种作物。近年来有关其发病机制、致病机理、防治策略等相关报道层出不穷，而从类似的致病菌中寻找有益基因为人类所利用却鲜有报道。2008年辣椒疫霉全基因组序列草图由美国能源部基因研究所公布于众（网址http://genome.jgi-psf.org/Phyca11/Phyca11.home.html）并不断更新完善。通过生物信息学分析，越来越多的人们感兴趣的基因得以被发现进而为揭示其相关功能并被人们所利用提供了便利。我们研究的类单胺氧化酶C类水合酶（MaoC-like hydratase，MaoC）即是在对其全基因组序列分析的基础上获得的一个新基因。MaoC在连接脂肪酸的β-氧化到聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate，PHA）的生物合成过程中具有加水作用，是最近被发现的一种新型R型水合酶。全球化的环境问题使得人们越来越关注于可生物降解材料的开发与使用。在被研究中的可生物降解材料中，PHA以其所具有的生物降解性、生物相容性、热塑性和机械性能成为一种理想的“绿色塑料”替代物。所以，许多科学家正在尝试研制低成本高产出的PHA生产方案。PHA生产成本的降低可以使其成为那些在自然坏境中很难分解的传统塑料的理想替代物，即作为“绿色塑料”被使用。MaoC即是首先在大肠杆菌中被发现的一种新型R型水合酶，它在脂肪酸的β-氧化到PHA的生物合成过程中起重要作用：MaoC作为R型水合酶的新成员可以提供PHA合成的前体物质，R-3-酮酰基辅酶A。我们在辣椒疫霉菌中克隆到了一个新MaoC基因，获得了其蛋白晶体并解析了其高分辨率三维结构，以结构为基础对其功能进行了深入研究。具体总结如下：1.在致病菌辣椒疫霉中克隆到一个有益基因MaoC，对其进行了原核表达，并对表达出的重组蛋白利用亲和层析、阴离子柱交换层析、分子排阻层析等手段进行了纯化，得到了具有较高纯度的稳定重组蛋白；利用特异性的酶活实验以巴豆酰辅酶A为底物对重组纯蛋白进行了酶活测定，结果显示重组纯蛋白具有乙酰辅酶A水合酶活性，达到58.1U/mg，MaoC因其乙酰辅酶A水合酶活性而成为与PHA合成相关的众多酶类的一员，是一种新型的R型水合酶，为PHA的合成提供前体物质，R-3-酮酰基辅酶A；2.采用气相扩散悬滴结晶法获得了MaoC高质量蛋白晶体，并用分子置换法解析出分辨率达1.93的晶体结构；对其三维结构进行了细致描述与分析：MaoC具有R型水合酶类典型的结构折叠，分为明显的N-区域和C-区域，两个区域间由一个盐桥相连；具有典型的称为“热狗折叠”的保守结构域，并且N-区域不完整，而C-区域是完整的“热狗折叠”；MaoC通过四个α螺旋相互作用形成了同源二聚体结构，且参与二聚化作用的氨基酸在R型水合酶中是高度保守的；结构上的精细分析与比对还发现MaoC存在一段潜在的活性抑制片段；3.以序列和结构比对为基础，确定了MaoC的催化中心为以下三个氨基酸：D194、H199和G217。为了验证其催化作用我们做了三个定点突变：D194E、H199Q和G217A；对三个突变体重组蛋白进行了纯化，并对纯蛋白进行了圆二色性、蛋白杂交和分子排阻层析验证，以确定其分子量及蛋白的真实性等；酶活测定结果显示三个氨基酸中D194和H199对MaoC行使酶活性起重要作用，G217起次要作用，具体作用方式为：D194通过吸引催化水分子上的一个质子而激活水分子，活化了的水分子攻击底物巴豆酰辅酶A上的碳原子，同时H199对底物上的碳原子贡献一个质子以使反应顺利进行，而G217通过氢键作用与底物硫酯键上的碳酰基结合，起到稳定底物的作用；4.二聚体是MaoC的活性形式，MaoC通过四个α螺旋相互作用形成了同源二聚体结构。通过序列和结构比对分析发现，参与二聚化作用的氨基酸在不同的R型水合酶中是高度保守的，同时大部分已报道的R型水合酶结构均为二聚体结构，并且与MaoC具有类似的作用方式。基于结构上的分析与比对，我们推测二聚化作用对MaoC行使酶活性是必须的。为了验证这一推测，我们做了三个定点突变：R23D，M27E和L191D；对三个突变体纯蛋白进行分子排阻层析验证表明三个突变体均成功破坏了MaoC的二聚化作用，成为单体蛋白；酶活测定结果显示三个突变体单体蛋白均丧失活性，证实二聚化作用对MaoC行使酶活性是必须的；本研究首次通过生化实验证实二聚化作用对MaoC酶活起关键作用，考虑到二聚化作用在R型水合酶类蛋白上的普遍存在性，我们的结论即二聚化作用对其行使正常酶活是必须的可能对此类蛋白具有普遍适用性；一个单体结构可能会更好的解释其机制，然而我们对MaoC单体蛋白的结晶实验未能成功；5.以结构为基础我们对MaoC进行了酶工程改造，以期得到与野生型蛋白相比具有较高酶活的突变体。结构分析表明一段非保守的插入片段可能对MaoC的酶活调节起作用。如果我们的假设正确的话，删除此片段将会对MaoC的活性产生影响。基于此假设我们对此区域进行了定点突变与片段删除突变，并对纯化后的突变体重组蛋白进行了酶活测定，结果显示两个突变体分别有较大幅度的活性提高：突变体Del63-71酶活为91.2U/mg，约为野生型蛋白的1.5倍；突变体Del63-88酶活为126.7U/mg，约为野生型蛋白的两倍；而定点突变对MaoC酶活基本无影响；分子排阻层析实验表明突变体活性的增强与其聚合状态无关，因为两个活性增强突变体均为二聚体；我们的研究表明MaoC上非保守的插入片段对其活性有抑制作用。随着世界环境问题变得越来越严峻，发展绿色环保塑料以改善环境迫在眉睫。在本研究中，我们报道了一个与PHA生物合成相关的新型水合酶结构，并且对其活性调节机制进行了研究与改进，这些研究将为以更低的成本生产PHA提供有效信息。

全文目录


符号说明  5-13
中文摘要  13-16
Abstract  16-19
1 文献综述  19-57
  1.1 辣椒疫霉及其全基因组  19-25
    1.1.1 辣椒疫病简介  19-21
    1.1.2 辣椒疫病发病原因总结  21
      1.1.2.1 土壤因素  21
      1.1.2.2 温、湿度因素  21
      1.1.2.3 其它因素  21
    1.1.3 辣椒疫病防治策略  21-23
      1.1.3.1 栽培防治  22
      1.1.3.2 化学防治  22
      1.1.3.3 生物防治  22-23
    1.1.4 防治中存在的问题  23-24
    1.1.5 辣椒疫霉基因组学研究进展  24-25
  1.2 生物塑料及其发展  25-28
    1.2.1 传统塑料产业发展受到限制  25-26
    1.2.2 生物塑料及其替代传统塑料的优势  26-27
      1.2.2.1 塑料的分类  26
      1.2.2.2 生物塑料及其分类  26-27
      1.2.2.3 生物塑料的优点  27
    1.2.3 生物塑料的开发及应用  27
    1.2.4 面临的问题与挑战  27-28
      1.2.4.1 价格高昂  27
      1.2.4.2 供应有限  27
      1.2.4.3 观念问题  27-28
      1.2.4.4 其它问题  28
    1.2.5 中国的生物塑料产业发展  28
  1.3 生物塑料之聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate，PHA）  28-34
    1.3.1 聚羟基脂肪酸酯（PHA）是一种新型的生物塑料  28-29
    1.3.2 PHA 的结构与合成  29-31
    1.3.3 PHA 的性能  31-32
      1.3.3.1 一般性能  31
      1.3.3.2 生物降解性能  31
      1.3.3.3 PHA 的缺点  31-32
    1.3.4 PHA 的应用  32-33
      1.3.4.1 塑料及农业领域  32
      1.3.4.2 医药领域  32-33
      1.3.4.3 其他领域  33
    1.3.5 存在的问题与挑战  33-34
  1.4 PHA 合成相关酶类研究  34-40
    1.4.1 PHA 在微生物及植物体内的合成研究  34-35
    1.4.2 PHA 的合成过程受多种酶调控  35-37
    1.4.3 PHA 的合成过程及作用机制  37-38
    1.4.4 R 型水合酶（R-hydratase）是 PHA 合成过程中一种重要酶  38-40
  1.5 MaoC 是与 PHA 生物合成相关的一种重要新型 R 型水合酶  40-44
    1.5.1 MaoC 可以合成 PHA 的前体物质  40-41
    1.5.2 MaoC 及其同源酶类酶学研究  41
    1.5.3 MaoC 及其同源酶类结构生物学研究  41-44
  1.6 蛋白质晶体学及结构生物学  44-55
    1.6.1 蛋白表达与纯化  45-48
      1.6.1.1 表达载体的类型  45
      1.6.1.2 蛋白质的纯化  45-48
    1.6.2 蛋白质晶体学重要性  48
    1.6.3 蛋白质晶体学介绍  48-52
      1.6.3.1 蛋白质 X 射线晶体学的一般过程  49-50
      1.6.3.2 蛋白质晶体生长的原理及影响因素  50
      1.6.3.3 蛋白质晶体生长的方法  50-52
    1.6.4 蛋白质结构解析简介  52-54
    1.6.5 结构生物学发展及现状  54-55
  1.7 研究目的及意义  55-57
2 材料与方法  57-78
  2.1 实验材料  57-60
    2.1.1 载体与菌株  57
    2.1.2 酶、生化试剂及试剂盒等  57
    2.1.3 溶液配制  57-59
      2.1.3.1 贮存液配制  57-58
      2.1.3.2 其它溶液配制  58-59
    2.1.4 实验仪器及耗材  59-60
  2.2 实验方法  60-78
    2.2.1 MaoC 蛋白结构分析  60
    2.2.2 目的基因片段的克隆及原核表达载体构建  60-65
      2.2.2.1 构建突变体引物设计  60-62
      2.2.2.2 突变体 PCR 扩增及阳性克隆鉴定  62-63
      2.2.2.3 原核表达载体 pET-28a 质粒提取  63-64
      2.2.2.4 突变体原核表达重组载体的构建与鉴定  64-65
    2.2.3 突变体重组蛋白的表达  65-67
      2.2.3.1 目的蛋白的试表达  65-66
      2.2.3.2 蛋白表达条件优化  66
      2.2.3.3 表达蛋白的大量表达  66-67
    2.2.4 重组蛋白的纯化  67-69
      2.2.4.1 亲和层析纯化  67-68
      2.2.4.2 离子交换层析纯化  68
      2.2.4.3 分子排阻层析纯化  68-69
    2.2.5 重组蛋白验证及酶活检测  69-72
      2.2.5.1 重组蛋白的透析  69-70
      2.2.5.2 重组蛋白浓度测定  70
      2.2.5.3 重组蛋白的圆二色性分析  70-71
      2.2.5.4 重组蛋白的 Western blotting 杂交验证  71
      2.2.5.5 重组蛋白的酶活测定  71-72
    2.2.6 失活突变体重组蛋白与底物共结晶  72-74
      2.2.6.1 突变体纯蛋白的获取  72-73
      2.2.6.2 突变体纯蛋白与底物共结晶  73
      2.2.6.3 晶体优化  73-74
    2.2.7 晶体数据收集与处理  74-75
      2.2.7.1 晶体 X 衍射数据收集  74-75
      2.2.7.2 衍射数据处理  75
    2.2.8 结构解析与修正  75-78
      2.2.8.1 分子置换法解析结构  76
      2.2.8.2 结构修正  76-78
3 结果与分析  78-119
  3.1 MaoC 蛋白结构分析  78-84
    3.1.1 氨基酸序列同源性分析  78-79
    3.1.2 MaoC 单体结构描述  79-82
    3.1.3 MaoC 二聚体结构描述  82-84
    3.1.4 MaoC 与底物 Crotonyl-CoA 模拟结合复合结构描述  84
  3.2 MaoC 活性位点分析与验证  84-91
    3.2.1 MaoC 与其同源结构比对分析  84-86
    3.2.2 MaoC 活性位点突变与突变体活性检测  86-88
    3.2.3 MaoC 及其突变体验证  88-91
      3.2.3.1 MaoC 突变体测序验证  88-89
      3.2.3.2 圆二色性 CD 分析  89-90
      3.2.3.3 Western blotting 杂交验证  90
      3.2.3.4 分子排阻层析验证  90-91
  3.3 MaoC 两个失活突变体与底物共结晶  91-99
    3.3.1 失活突变体 H199Q 与底物 Crotonyl-CoA 共结晶  91-95
      3.3.1.1 H199Q 纯蛋白的获得  91-93
      3.3.1.2 H199Q 结晶条件初筛  93-94
      3.3.1.3 H199Q 结晶条件优化  94-95
      3.3.1.4 H199Q 蛋白晶体 X 衍射分析  95
    3.3.2 失活突变体 D194N 与底物 Crotonyl-CoA 共结晶  95-98
      3.3.2.1 D194N 纯蛋白的获得  95
      3.3.2.2 D194N 结晶条件初筛  95-96
      3.3.2.3 D194N 结晶条件优化  96-97
      3.3.2.4 D194N 蛋白晶体 X 衍射分析  97
      3.3.2.5 D194N 蛋白晶体 X 衍射数据收集  97-98
    3.3.3 失活突变体 D194N 结构解析  98-99
  3.4 二聚化作用对 MaoC 活性的影响  99-106
    3.4.1 参与 MaoC 二聚化作用的氨基酸  99-100
    3.4.2 MaoC 去二聚化作用突变体的获得  100-103
      3.4.2.1 去二聚化作用突变策略  100-101
      3.4.2.2 去二聚化作用突变体测序验证  101-102
      3.4.2.3 去二聚化作用突变体纯化  102-103
    3.4.3 突变体去二聚化作用效果验证  103-104
    3.4.4 去二聚化作用突变体活性检测  104-106
  3.5 以结构为基础的 MaoC 酶工程改造  106-119
    3.5.1 关键位点定点突变对 MaoC 酶活性影响  106-113
      3.5.1.1 定点突变氨基酸位点的选择  106-109
      3.5.1.2 突变体测序验证  109-111
      3.5.1.3 突变体表达与纯化  111-112
      3.5.1.4 突变体酶活检测  112-113
    3.5.2 删除片段突变对 MaoC 酶活性影响  113-119
      3.5.2.1 删除片段的选择  113-115
      3.5.2.2 突变体测序验证  115
      3.5.2.3 突变体表达与纯化  115-116
      3.5.2.4 突变体酶活检测  116-119
4 结论与讨论  119-125
  4.1 MaoC 生物学功能  119
  4.2 MaoC 三维结构特性  119-121
  4.3 活性中心及催化机理  121-122
  4.4 失活突变体与底物共结晶  122
  4.5 二聚化作用对 MaoC 活性的影响  122-123
  4.6 以结构为基础的 MaoC 酶工程改造  123-125
5 博士期间其它工作小结  125-139
参考文献  139-153
附录  153-154
致谢  154-155
论文发表情况  155-156
博士学位论文内容简介及自评  156

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 蔬菜病虫害 > 茄果类病虫害 > 辣椒病虫害
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