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重组AAV（rAAV）杆状病毒生产系统的研究

作　者: 雷求刚
导　师: 钱其军
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: AAV载体 杆状病毒 rAAV2-EGFP 病毒生产
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


腺相关病毒(Adeno-associated Viruses, AAV)感染人体后不会产生致病性,通过去除病毒基因仅保留两端ITR序列进一步增加了重组AAV载体的安全性,而且其携带的基因表达期比较长,因此在基因治疗领域越来越受到人们的关注。然而,传统的生产方式很难满足临床上对AAV载体高产量的需求,这成为AAV载体在临床应用上的一个重大瓶颈,探索一种高效、安全和可放大的生产方式以得到高产量的AAV载体是满足其临床需求的必要条件。除了腺病毒和单纯疱疹病毒外,杆状病毒也能为AAV的复制包装提供辅助功能,而且杆状病毒不会像腺病毒和单纯疱疹病毒一样对人体产生毒性,因此,利用杆状病毒携带AAV包装所需的顺式和反式作用元件,借助杆状病毒对昆虫细胞Sf9的感染性,在昆虫细胞中生产重组AAV载体,是一种较为理想且能满足临床需求的新型重组AAV生产方式。重组AAV的杆状病毒生产系统需要两类反式因子:一是AAV的复制蛋白Rep78和Rep52,另外一类是AAV的衣壳蛋白Cap1,Cap2和Cap3,可以由两个杆状病毒分别携带或者由单一的杆状病毒携带。该系统所需的另外一个顺式组分是携带AAV2的ITR及外源表达框(如EGFP)的重组杆状病毒。根据AAV2的Rep和Cap基因序列设计引物,PCR扩增Rep78、Rep52、Cap1及Cap2+3。Rep78和Cap2+3一组,Rep52和Cap1一组分别构建到pFastBacDual载体中。另外,我们借助一个能在昆虫细胞中起作用的内含子将Rep和Cap基因构建到一个同一载体中,借助内含子的作用,Rep表达框能同时表达Rep78和Rep52,而Cap表达框能同时表达Cap1和Cap2+3。将这几个载体分别转化DH10Bac?感受态通过转座重组得到重组Bacmid ,转染昆虫细胞得到重组杆状病毒Bac-AAV2Rep78Cap2+3、Bac-AAV2Rep52Cap1和Bac-AAV2RepiCapi。采用类似的方法得到重组杆状病毒Bac-AAV2EGFP。其中,Bac-AAV2Rep78Cap2+3, Bac-AAV2Rep52Cap1和Bac-AAV2EGFP共感染Sf9细胞构成三杆状病毒生产系统,Bac-AAV2RepiCapi和Bac-AAV2EGFP共感染Sf9细胞构成两杆状病毒生产系统,两套系统分别用来生产带EGFP的重组AAV2载体rAAV2-EGFP。经初步研究证明,三杆状病毒系统和二杆状病毒系统都能成功包装出rAAV2-EGFP病毒。生产出的病毒经AAV纯化试剂盒纯化,通过定量PCR检测病毒载体基因组产量,结果显示:三杆状病毒生产能力为每个Sf9细胞4.85×103VG(Virus vector genomes,病毒载体基因组),而二杆状病毒达到了每个Sf9细胞6.12×10~4VG。进一步转导HEK293细胞后经流式细胞仪检测:前者生产能力为每个Sf9细胞3TU (Transduction Unit,转导单位),后者则达到30TU左右,且感染HEK293细胞后都能看到较强的绿色荧光表达,说明病毒活力较强。从各项检测的结果来看,二杆状病毒系统的生产能力更强,如果将其放大到较大规模的悬浮培养生产方式,产量和生产效率将得到极大提高。因此,杆状病毒生产系统这种高效、安全、可放大的生产方式大大简化了生产过程,降低了生产成本,能够满足基因治疗和临床上对AAV产量的需求。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-15
缩略词表  15-16
第一部分 文献综述与实验设计  16-34
  第一章 腺相关病毒载体及其在基因治疗中的应用  17-22
    1 腺相关病毒简介.  17-18
    2 腺相关病毒载体及其在基因治疗中的应用  18-22
      2.1 腺相关病毒载体  18-20
        2.1.1 重组腺相关病毒（rAAV）制备的基本原理  18-19
        2.1.2 腺相关病毒载体的特点  19-20
      2.2 AAV 载体在基因治疗上的应用  20-22
  第二章 腺相关病毒载体（rAAV）生产方式的进展  22-28
    1 质粒转染加腺病毒感染的方式  22-23
    2 完全采用质粒转染的方式  23
    3 采用稳定细胞系的方式.  23-25
    4 新型rAAV 生产系统:杆状病毒-昆虫细胞生产系统  25-28
  第三章 实验设计方案及课题内容  28-34
    1 本课题研究目的和意义  28
    2 实验设计方案.  28-29
    3 课题创新点.  29-30
    4 实验内容及流程图.  30-34
第二部分 研究论文  34-82
  第一章 重组pFastBacDual 载体的构建及菌内转座重组产生重组 Bacmid  35-60
    1 实验器材  35-40
      1.1 材料  35
      1.2 仪器和设备.  35-36
      1.3 试剂及试剂盒  36
      1.4 主要试剂的配制  36-38
      1.5 所用引物  38-39
      1.6 所用LINKER  39-40
    2 实验方法  40-51
      2.1 重组pFBD 载体构建  40-50
        2.1.1 pFBD-AAV2Rep78Cap2+3 及pFBD-AAV2Rep52Cap1 载体的构建  40-45
        2.1.2 pFBD-AAV2RepiCapi 载体的构建  45-48
        2.1.3 pFBD-AAV2EGFP 载体的构建  48-50
      2.2 重组pFBD 载体在DH108ac?中的转座重组及重组Bacmid 的提取  50-51
        2.2.1 重组pFBD 载体在DH108ac?中的转座重组  50
        2.2.2 重组Bacmid 的大量抽提及PCR 鉴定  50-51
    3 结果  51-58
      3.1 相关基因或片段的PCR 结果  51-54
      3.2 pFBD-AAV2Rep78 及pFBD-AAV2Rep52 的酶切鉴定  54-55
      3.3 pFBD-AAV2Rep78Cap2+3 及pFBD-AAV2Rep52Cap1 载体的酶切鉴定  55
      3.4 pFBD-AAV2Repi 载体的酶切鉴定  55-56
      3.5 pFBD-AAV2RepiCapi 载体的酶切鉴定  56
      3.6 pFBD-AAV2EGFP 的酶切鉴定  56
      3.7 重组Bacmid 的PCR 鉴定.  56-58
    4 讨论  58-60
  第二章 重组杆状病毒的包装、扩增及滴度测定  60-69
    1 实验器材  60-61
      1.1 材料与试剂.  60
      1.2 仪器和设备.  60
      1.3 荧光定量PCR 引物  60-61
    2 实验方法  61-64
      2.1 Sf9 细胞的培养  61
      2.2 重组杆状病毒的包装  61
      2.3 重组杆状病毒的扩增  61-62
      2.4 重组杆状病毒DNA 的提取  62
      2.5 荧光定量PCR 测定重组杆状病毒的滴度  62-64
        2.5.1 Bac-AAV2Rep52Cap1、Bac-AAV2Rep78Cap2+3 和Bac-AAV2RepiCapi 的滴度测定.  62-63
        2.5.2 Bac-AAV2EGFP 的滴度测定  63-64
    3 结果  64-67
      3.1 重组Bacmid 的转染效果  64-65
      3.2 重组杆状病毒的滴度测定  65-67
        3.2.1 Bac-AAV2Rep52Cap1、Bac-AAV2Rep78Cap2+3 和Bac-AAV2RepiCapi 的滴度测定.  65-66
        3.2.2 Bac-AAV2EGFP 的滴度测定  66-67
    4 讨论  67-69
  第三章 重组 AAV 的生产、纯化、滴度和活力测定  69-82
    1 实验器材  69-72
      1.1 材料与试剂.  69
      1.2 仪器和设备.  69-70
      1.3 试剂的配制  70-72
    2 实验方法  72-76
      2.1 Western Blot 检测Rep Cap 基因的表达  72-73
      2.2 rAAV2-EGFP 的生产  73-74
        2.2.1 rAAV2-EGFP 的三杆状病毒包装系统  73
        2.2.2 rAAV2-EGFP 的二杆状病毒包装系统  73-74
      2.3 rAAV2-EGFP 的纯化  74
      2.4 滴度测定及生产能力的初步评估  74-75
        2.4.1 病毒基因组滴度测定及生产能力评估  74-75
        2.4.2 转导单位数滴度测定及生产能力评估  75
      2.5 病毒活力的检测  75-76
    3 结果  76-80
      3.1 杆状病毒生产系统Rep Cap 基因表达的Western 检测  76
      3.2 rAAV2-EGFP 病毒基因组滴度检测及生产能力的初步评估  76-77
      3.3 rAAV2-EGFP 转导单位数滴度检测及生产能力的初步评估  77-79
      3.4 病毒活力的检测  79-80
        3.4.1 三杆状病毒生产系统 rAAV2-EGFP 病毒活力检测  79
        3.4.2 二杆状病毒生产系统 rAAV2-EGFP 病毒活力检测  79-80
    4 讨论  80-82
结论  82-84
参考文献  84-88
在学期间发表的文章  88-89
致谢  89

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因工程的应用
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