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家蚕小热休克蛋白22.6的克隆表达与功能初步分析

作　者: 郑碧
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕小热休克蛋白22.6 原核表达 多克隆抗体 热激 分子伴侣
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


小热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)是一类受热处理后诱导产生的蛋白家族。作为重要的分子伴侣,小热休克蛋白参与细胞骨架稳定、细胞迁移、调节细胞的生长与分化,并与细胞抗凋亡有关。我们从本实验室构建的家蚕cDNA文库中获得了一条序列,全长841 bp,其开放式阅读框(ORF)长度为597 bp,编码198个氨基酸残基,包含一个高度保守的α-crystallin结构域。为了制备抗BmHSP22.6蛋白的多克隆抗体,我们将BmHSP22.6基因克隆到表达载体pET-28a上,成功构建了融合蛋白表达质粒pET-28a-BmHSP22.6。将该重组子转化大肠杆菌BL21 Star(DE3),用终浓度为1 mM的IPTG诱导重组菌成功表达了融合蛋白His-BmHSP22.6,超声裂解发现该蛋白以可溶形式存在。经亲和层析纯化的目的蛋白His-BmHSP22.6作为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该蛋白的多克隆抗体,间接ELISA法测得抗体效价达1:6400以上,Western blot检测抗体的特异性良好,该抗体符合进行下一步实验的要求。Western blot检测发现,BmHSP22.6蛋白在家蚕蛾时期和五龄幼虫的头、表皮中的表达量最高。我们对家蚕吐丝期幼虫和蛹进行热激实验,提取不同组织的蛋白,采用ELISA半定量法和Western blot法检测不同组织热激处理后的蛋白表达变化情况。细胞免疫荧光实验结果表明,BmHSP22.6蛋白存在于家蚕卵巢细胞BmN的细胞质中,经热激处理后,表达量显著上升。这些为小热休克蛋白抵抗环境压力(比如热刺激)的保护机制提供了很好的解释。研究BmHSP22.6对溶菌酶聚集的影响时,发现不同浓度BmHSP22.6在不同程度上抑制了溶菌酶聚集,说明其具有分子伴侣功能。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-12
缩略语  12-13
第一章 小热休克蛋白的综述  13-20
  引言  13
  1 热休克蛋白的发现与命名  13-14
  2 小热休克蛋白的结构及作用机理  14-16
  3 小热休克蛋白的生物学作用  16-18
    3.1 分子伴侣功能  16
    3.2 使生物获得耐热性  16-17
    3.3 与细胞凋亡相关  17
    3.4 免疫学功能  17
    3.5 稳定细胞骨架  17-18
    3.6 参与调节细胞的生长和分化  18
  4 与疾病的关系  18
  5 展望  18-20
第二章 实验方案设计  20-22
  1 研究目的和意义  20
  2 研究内容  20-21
  3 实验流程图  21-22
    3.1 原核表达及分布情况  21-22
第三章 序列分析  22-30
  1 生物信息学工具  22
  2 方法  22-23
    2.1 BmHSP22.6 基因的获得  22
    2.2 BmHSP22.6 基因的序列分析  22-23
  3 结果  23-29
    3.1 BmHSP22.6 基因的序列  23
    3.2 BmHSP22.6 蛋白氨基酸序列同源性分析  23-24
    3.3 BmHSP22.6 蛋白疏水性分析  24-25
    3.4 BmHSP22.6 蛋白二级结构的预测  25
    3.5 BmHSP22.6 蛋白高级结构的预测  25-26
    3.6 BmHSP22.6 蛋白定位的预测  26
    3.7 BmHSP22.6 蛋白的信号肽分析  26-27
    3.8 BmHSP22.6 蛋白磷酸化位点预测  27
    3.9 BmHSP22.6 蛋白进化树的构建  27-28
    3.10 BmHSP22.6 蛋白电子表达谱分析  28-29
  4 讨论  29-30
第四章 家蚕BmHSP22.6 基因的克隆、表达与纯化  30-42
  1 材料与试剂  30-33
    1.1 材料  30
    1.2 试剂与仪器  30
    1.3 试剂的配制  30-33
  2 方法  33-38
    2.1 引物的设计  33
    2.2 质粒提取  33
    2.3 PCR 扩增  33
    2.4 PCR 产物的纯化  33-34
    2.5 双酶切PCR 产物与表达载体pET-28a 并回收  34
    2.6 连接反应  34
    2.7 感受态细胞的制备(CaCl_2 法)  34-35
    2.8 连接产物的转化  35
    2.9 重组克隆的筛选与鉴定  35-36
    2.10 重组质粒转化E.coli BL21 Star (DE3)  36
    2.11 重组质粒在大肠杆菌中表达  36
    2.12 SDS-PAGE 电泳分析  36-37
    2.13 融合蛋白的亲和层析  37
    2.14 融合蛋白的FPLC 纯化  37
    2.15 融合蛋白分子量的质谱鉴定  37-38
  3 结果  38-41
    3.1 PCR 扩增目的片段  38
    3.2 重组质粒的PCR 扩增和双酶切鉴定  38-39
    3.3 测序  39
    3.4 重组蛋白的诱导表达  39
    3.5 融合蛋白的亲和层析  39-40
    3.6 FPLC 分离纯化  40-41
    3.7 融合蛋白分子量的质谱鉴定  41
  4 讨论  41-42
第五章 多克隆抗体的制备与鉴定  42-49
  1 材料与试剂  42-44
    1.1 材料  42
    1.2 试剂与仪器  42
    1.3 试剂的配制  42-44
  2 方法  44-46
    2.1 测蛋白含量  44
    2.2 制备抗原  44
    2.3 免疫动物  44
    2.4 多克隆抗血清制备  44
    2.5 抗体的纯化  44-45
    2.6 ELISA 测定抗血清效价  45
    2.7 Western blot 检测抗体特异性  45-46
  3 结果  46-48
    3.1 纯化蛋白定量  46
    3.2 多克隆抗体的纯化  46-47
    3.3 抗体效价测定  47
    3.4 Western blot 检测  47-48
  4 讨论  48-49
第六章 热激实验  49-60
  1 材料与试剂  49-51
    1.1 材料  49
    1.2 试剂  49
    1.3 试剂的配制  49-51
  2 方法  51-53
    2.1 Western blot 样品的获得  51
    2.2 Western blot 检测BmHSP22.6 蛋白的分布  51-52
    2.3 热激实验  52
    2.4 间接免疫荧光实验  52-53
  3 结果  53-58
    3.1 Western blot 分析家蚕五龄幼虫各组织中BmHSP22.6 的分布  53
    3.2 Western blot 分析家蚕发育过程中BmHSP22.6 蛋白表达量的变化  53
    3.3 ELISA 半定量标准曲线  53-54
    3.4 热激处理后头和皮中BmHSP22.6 的表达变化情况  54-55
    3.5 吐丝期幼虫和蛹热激处理后的表达水平  55-56
    3.6 吐丝期幼虫和蛹热激处理后的表达变化情况  56-57
    3.7 间接免疫荧光实验  57-58
  4 讨论  58-60
第七章 功能初步研究  60-64
  1 材料与试剂  60
    1.1 材料  60
    1.2 试剂与设备  60
  2 方法  60
    2.1 分子伴侣活性测定  60
  3 结果  60-62
    3.1 分子伴侣活性测定结果  60-62
  4 讨论  62-64
结论  64-65
参考文献  65-69
致谢  69

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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